毕赤酵母Muts与Mut+重组子表达蝎毒镇痛活性肽BmK AngM1水平比较

・９１Ｏ・　药学学报Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ　２０１５，５０（７）：９１０－９１５　毕赤酵母Ｍｕｔ　与Ｍｕｔ＋重组子表达蝎毒镇痛活性肽　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１水平比较　王庆华，梁　兰，陈晶晶，巩　婷，侯　琦，杨金玲　，朱　平　（中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室＆　卫生部天然药物生物合成重点实验室，北京１０００５０）　摘要：蝎毒镇痛活性肽ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１是从东亚钳蝎　ｕｔｈｕｓ　ｍａｒｔｅｎｓｉｉ　Ｋａｒｓｃｈ１蝎毒中分离得到的一种新型长　链蝎毒素，其镇痛活性强且毒性低，有望开发成镇痛新药。本文将ＢｍＫＡｎｇＭ１基因转入毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）　ＧＳ１１５，筛选得到甲醇利用缓慢型（Ｍｕｔ　）和快速型（Ｍｕｔ　）的重组子；采用实时荧光定量ＰＣＲ方法，检测了Ｍｕｔ　重组子中ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１基因的拷贝数，筛选出含单拷贝ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１基因的Ｍｕｔ　重组子；在相同培养条件下，比　较了含单拷贝ＢｍＫＡｎｇＭ１基因的Ｍｕｔ。和Ｍｕｔ　重组子表达ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１的水平。结果表明　Ｍｕｔ。重组子中ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１基因转录水平是Ｍｕｔ　重组子的２．７倍，Ｍｕｔ。重组子中ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１蛋白表达量是Ｍｕｔ　重组子的１．５倍。　因此，Ｍｕｔ。重组子比Ｍｕｔ　重组子具有更强的ＢｍＫＡｎｇＭ１表达能力。　关键词：蝎毒镇痛活性肽；毕赤酵母；基因拷贝数；Ｍｕｔ　重组子；Ｍｕｔ　重组子　中图分类号：Ｒ９３１　文献标识码：Ａ　文章编号：０５１３．４８７０（２０１５）０７．０９１０－０６　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１　ｉｎ　Ｍｕｔ　ａｎｄ　Ｍｕｔ＋　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＷＡＮＧ　Ｑｉｎｇ—ｈｕａ，ＬＩＡＮＧ　Ｌａｎ，ＣＨＥＮ　Ｊｉｎｇ－ｊ　ｉｎｇ，ＧＯＮＧ　Ｔｉｎｇ，ＨＯＵ　Ｑｉ，　ＹＡＮＧ　Ｊｉｎ．１ｉｎｇ　，ＺＨＵ　Ｐｉｎｇ　（Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＢｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｆＮａｔｏｕｒａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｆ　ｏＮａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｍｉｎｉｓｔｙ　ｒｆＨｅａｌｏｔｈ　ｆＰＲＣ　ｏＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＭａｔｅｒｉａ　Ｍｅｄｉｃａ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｆＭｅｄｉｏｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｏ＇ｉｎｇ　１０００５０，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１　ｉｓ　ａ　ｌｏｎｇ．ｃｈａｉｎ　ｓｃｏｒｐｉｏｎ　ｔｏｘｉｎ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｖｅｎｏｍ　ｏｆ　Ｂｕｔｈｕｓ　ｍａｒｔｅｎｓｉｉ　Ｋａｒｓｃｈ．　Ｉｔ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ　ｔｏ　ｅｘｈｉｂｉｔ　ｅｖｉｄｅｎｔ　ａｎａｌｇｅｓｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ａｎｄ　ｌｏｗ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ，ａｎｄ　ｈａｓ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｔｏ　ｂｅ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ａｎａｌｇｅｓｉｃ　ｄｒｕｇ．Ｔｈｅ　ＢｍＫＡｎｇＭ１　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ　ＧＳ１　１５．　Ｍｕｔ　ａｎｄ　Ｍｕｔ。ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｂｙ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　Ｍｕｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１　ｇｅｎｅ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｕｔ’ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｗａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｕｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｓｉｎｇｌｅ　ｃ０ｐｙ　ｏｆ　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１　ｇｅｎｅ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　１ｅｖｅｌ　ｏｆ　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｕｔ。ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｗａｓ　２．７　ｆｏｌｄ　ｏｆ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｕｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ　１　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｕｔ。ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｗａｓ　１．５　ｆｏｌｄ　ｏｆ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｕｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ．Ｍｕｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｓｈｏｗｅｄ　ｂｅａｅｒ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ　１　ｔｈａｎ　Ｍｕｔ’ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１；Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ；ｇｅｎｅ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ；Ｍｕｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ；Ｍｕｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　收稿日期：２０１５—０４．２９；修回日期：２０１５—０６一叭．　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０８７３３８４）；北京市自然科学基金资助项目（７１２２１１５）；天然药物活性物质与功能国家重点实验室自主课题　通讯作者Ｔｅｌ：８６—１０　６３１６５１９９，Ｆａｘ：８６－１０—６３１６５１９７，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙａｎ￣ｌ＠ｉｍｍ．ａｃ．ｃｎ；ｚｈｕｐｉｎｇ＠ｉｍｍ．ａｃ．ｃｎ　王庆华等：毕赤酵母Ｍｕｔ。与Ｍｕｔ　重组子表达蝎毒镇痛活性肽ＢｍＫＡｎｇＭ１水平比较　。９１１‘　全蝎作为传统中药，具有多种药用功效，如抗肿　瘤、抗血栓和镇痛等［】，　。蝎毒素是蝎尾毒腺分泌的　多肽，是中药全蝎的主要活性成分。作为一种新型的　多肽类药物，蝎毒素表现出较好的研究潜力和应用　前景ｐ１Ｊ。蝎毒镇痛活性肽ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１是从东亚钳　蝎（Ｂｕｔｈｕｓ　ｍａｒｔｅｎｓｉｉ　Ｋａｒｓｃｈ）蝎毒中分离得到的一　种新型长链蝎毒素，其镇痛活性强且毒性低，有望开　发成镇痛新药【８】。但ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１在蝎毒中含量极低，　难以得到足够量的纯品，这大大了其作用机制　的深入研究及实际应用的推广。鉴于此，作者通过将　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１基因转入毕赤酵母，获得了能产生重组　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１的工程菌株。　毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）的重要生物学特性是　能利用甲醇作为唯一的碳源和能源。根据代谢甲醇速　率的不同，重组毕赤酵母分为甲醇利用缓慢型（Ｍｕｔ。１　和快速型（Ｍｕｔ　１两种表型。这两种甲醇利用表型是　由重组载体在毕赤酵母中的重组方式决定的【　。外源　基因在毕赤酵母中的重组方式主要有两种【】川：一是含　有外源基因的重组载体通过双交换的方式整合到毕赤　酵母基因组中，产生的重组菌株基因型为Ｈｉｓ　Ｍｕｔ。。　由于醇氧化酶基因１　１）被外源基因置换，细胞　只能通过具有微弱转录能力的醇氧化酶基因２　ｏｘ２）表达的醇氧化酶来代谢甲醇，而ＡＯＸ２的活　性只有ＡＯＸ１的１／１０，因此细胞代谢甲醇速率很慢，　一般只有Ｍｕｔ　重组子的１／４，甚至更慢：二是含有外　源基因的重组载体通过单交换的方式整合到毕赤酵　母基因组中，产生的重组菌株基因型为Ｈｉｓ　Ｍｕｔ　。外　源基因插入ＡＯＸ１基因上游或下游，并且这一过程可　重复发生，因此可获得含更多拷贝外源基因的转化　子。由于Ｍｕｔ＋重组子中ＡＯＸＩ基因仍能正常表达，在　甲醇诱导下能产生大量的醇氧化酶，从而细胞代谢　甲醇能力较强，通过甲醇完全氧化途径为细胞提供　大量的能量，因此其利用甲醇能力与野生型相　Ｈ】。　Ｍｕｔ。和Ｍｕｔ　重组子对甲醇代谢速率不同。这对重组　菌株表达外源蛋白产生一定的影响，主要表现在外　源蛋白表达产率和细胞比生长速率等方面。　本实验将ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１基因转入毕赤酵母，得到　Ｍｕｔ　和Ｍｕｔ　重组子，采用实时荧光定量ＰＣＲ方法，　筛选出均含单拷贝ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１基因的重组子，进而　在基因转录和蛋白表达水平比较了这两种重组子在　表达ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１水平上的差异。　材料与方法　菌株和质粒重组质粒ｐＰＩＣ９Ｋ．ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１由　本实验室构建。ＢｍＫＡｎｇＭｌ基因根据其ｃＤＮＡ序列　（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０６２５６３）并结合毕赤酵母的密码子偏　爱性人工合成。本研究使用的菌株和质粒见表１。　Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｔｒａｉｎ／ｐｌａｓｍｉｄ　Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｏｒｉｇｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｍａｉｎｔ　ａｉｎｅｄ　ｉｎ　ａ　ｒｅｃＡ．ｅｎｄＡ　Ｅ　Ｐｕｒｃｈａｓｅｄ　ｆｉ－ｏｍ　Ｔｏｐｌ０　ＴＩＡＮＧＥＮ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　Ｈｏｓｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｆｏｒ　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１　Ｐｕｒｃｈａｓｅｄ　ｆｒｏｍ　ＧＳｌ１５　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　ｐＰＩＣ９Ｋ－　ＢｍＫＡｎｇＭ１，ＡＯＸ１　ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｏｕｒ　ｌａｂ　ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１　ｓｉｇｎａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ａｍｐ／　Ｋａｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　试剂和仪器试剂：普通Ｔａｑ聚合酶（北京全式　金生物技术有限公司）；质粒提取试剂盒和酵母基因　组ＤＮＡ提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；酵母　ＲＮＡ提取试剂盒和实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒（康为　世纪生物有限公司）；高效率逆转录试剂（ＴＯＹＯＢＯ　公司１：其他试剂均为国产分析纯。仪器：３Ｋ１８型低　温高速离心机（Ｓｉｇｍａ公司）；ＨＺＱ—Ｑ型振荡器（哈尔　滨东联电子技术开发有限公司）；Ｍｉｎｉ　２Ｄ型电泳仪　（Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司）；ＰＣＲ仪（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；实时荧光　定量ＰＣＲ仪（Ｒｏｃｈｅ公司）。　培养基ＹＰＤ培养基（１％酵母提取物、２％胰蛋　白胨、２％葡萄糖、固体培养基加１．５％琼脂）；ＬＢ培　养基（０．５％酵母提取物、１％胰蛋白胨、ｌ％氯化钠、　固体培养基加１．５％琼脂）；ＢＭＧＹ培养基（１％酵母提　取物、２％胰蛋白胨、１％甘油、０．１　ｍｏｌ・Ｌ１磷酸钾缓　冲液ｐＨ　６．０、１．３４％ＹＮＢ、４ｘ１０　％生物素１；ＭＤ平　板（２％葡萄糖、１．３４％ＹＮＢ、４ｘ１０　％生物素、１．５％　琼脂）；ＭＭ平板（２％葡萄糖、０．５％无水甲醇、１．３４％　ＹＮＢ、４ｘ１０　％生物素、１．５％琼脂１。　毕赤酵母转化和重组子筛选　参照Ｔｈｅ　Ｐｉｃｈｉａ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔ说明书，将重组质粒ｐＰＩＣ９Ｋ—ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１经　ＩＩ酶切线性化后，切胶回收带有目的基　因的大片段，通过ＬｉＣ１／ＳＳ　Ｃａｒｒｉｅｒ　ＤＮＡ／ＰＥＧ方法转　化毕赤酵母ｌ】　，涂布ＭＤ平板，３０℃培养２～３天。提　取转化子基因组ＤＮＡ，以５’ＡＯＸ／３’ＡＯＸ为引物（表　２）进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应体系：Ｔａｑ聚合酶（２×）　７．５　ＩｘＬ、５＇ＡＯＸ弓Ｉ物（１０￣ｔｍｏｌ－Ｌ一。）１　Ｌ、３＇ＡＯＸ弓Ｉ　物（１０￣ｔｍｏｌ‘Ｌ１）１　Ｌ、基因组ＤＮＡ（２０　ｎｇ）ｌ　、　ｄｄＨ２０４．５　。ＰＣＲ反应程序：９４℃５　ａｒｉｎ，（９４℃３０　Ｓ，　５２℃３０　Ｓ，７２℃２　ｍｉｎ）×２５循环，７２℃１０　ｍｉｎ。通过　　并进一步验证其表型，获得含单拷贝ＢｍＫ　ＡｎｇＭ１基　因的Ｍｕｔ。重组子。将重组质粒ｐＰＩＣ９Ｋ．　ＡｎｇＭ１　ＰＣＲ鉴定目的基因是否整合到毕赤酵母基因组中，王庆华等：毕赤酵母Ｍｍ。与Ｍｕｔ　重组子表达蝎毒镇痛活性肽ＢｍＫＡｎｇＭ１水平比较　・９１５・　【２】　Ｔａｎ　ＹＨ，Ｇｕｏ　ＪＳ．　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ａｎｄ　ａｎａｌｇｅｓｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｂｕｔｈｕｓ　ｍａｒｔｅｎｓｉｉ　Ｋａｒｓｃｈ［Ｊ］．Ｈｕｎａｎ　Ｇｕｉｄｉｎｇ　Ｊ　Ｔｒａｄｉｔ　Ｃｈｉｎ　Ｍｅｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（湖南中医药导报），　２００１．７：２１０—２１２．　［３】　Ｗａｎｇ　Ｃ，Ｓｔ　Ｌｅｇｅｒ　ＲＪ．Ａ　ｓｃｏｒｐｉｏｎ　ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｃｙ　ｏｆ　ａ　ｆｕｎｇａｌ　ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００７，２５：　１４５５－１４５６．　【４】　Ｈａｎ　Ｓ，Ｙｉ　Ｈ，Ｙｉｎ　ＳＪ，ｅｔ　ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｐｏｔｅｎｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｆｏｒ　Ｋｖ１．３　ｃｈａｎｎｅｌ，ａ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００８，２８３：１９０５８—　１９０６５．　【５］　Ｈｏｃｋａｄａｙ　ＤＣ，Ｓｈｅｎ　Ｓ，Ｆｉｖｅａｓｈ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．　Ｉｍａｇｉｎｇ　ｇｌｉｏｍａ　ｅｘｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　１３１Ｉ－ＴＭ一６０１［Ｊ】．Ｊ　Ｎｕｃｌ　Ｍｅｄ，２００５，４６：５８０—　５８６．　［６】　Ｄａｉ　Ｃ，Ｍａ　Ｚｈａｏ　Ｚ，ｅｔ　ａ１．Ｍｕｃｒｏｐｏｒｉｎ，ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｃａｔｉｏｎｉｃ　ｈｏｓｔ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｖｅｎｏｍ　ｏｆ　Ｌｙｃｈａｓ　ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ［Ｊ】　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００８，５２：３９６７—３９７２．　［７］　Ｍａ　Ｚｈａｏ　Ｒ，Ｈｅ　ｅｔ　ａ１．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖｅｎｏｍ　ｇｌａｎｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｃｏｒｐｉｏｎ　Ｓｃｏｒｐｉｏｐｓ　ｊｅｎｄｅｋｉ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｒ　ｔｈｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｃｏｒｐｉｏｎ　ｖｅｎｏｍ　ａｒｓｅｎａｌ［Ｊ】．ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００９，１０：２９０．　［８］　Ｃａｏ　Ｚ　Ｍｉ　ＺＭ，Ｃｈｅｎｇ　ＧＦ，ｅｔ　ａ１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｗｉｔｈ　ａｎａｌｇｅｓｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｃｏｒｐｉｏｎ　Ｂｕｔｈｕｓ　ｍａｒｔｅｎｓｉ　Ｋａｒｃｈ［Ｊ］．Ｊ　Ｐｅｐｔ　Ｒｅｓ，２００４，　６４：３３－４１．　【９】　Ｌｉ　Ｊ．Ｐｅｎｇ　ＹＹ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｐｈｙｔａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ　Ｍｕｔ　ａｎｄ　Ｍｕｔ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｈｙｔａｓｅ　［Ｊ］．Ｂｏｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｕｌｌ（生物技术通报），２００６，（０３）：５８—６２．　［１Ｏ】　Ｃｒｅｇｇ　ＪＭ，Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ　ＫＪ，Ｈｅｓｓｌｅｒ　Ａ　ｅｔ　ａ１．Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ａｓ　ａ　ｈｏｓｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ［Ｊ】．Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，１９８５，　５：３３７６－３３８５．　Ｋｕｐｃｓｕｌｉｋ　Ｂ，Ｓｅｖｅｌｌａ　Ｂ，Ｂａｌｌａｇｉ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｆｅｅｄ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　Ｍｕｔ。　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｃｔａＡｌｉｍｅｎｔ，２００１，３０：９９—１１１．　ｆ１２】　Ｖｅｌｌａｎｋｉ　ＲＮ，Ｐｏｔｕｍａｒｔｈｉ　Ｒ＇Ｍａｎｇａｍｏｏｒｉ　ＬＮ．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ　ｐｒｏ—　ｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，１　５８：２５—４Ｏ．　［１３】　Ｓｈｅｎ　Ｑ，Ｗｕ　Ｍ，Ｗａｎｇ　ＨＢ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ　ａｎｄ　ｃｏ・ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈａｐｅｒｏｎｅ　ｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｂｕｍｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］＿　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉａ１　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，９６：７６３—７７２．　［１４］　Ｃｈｉｕｒｖｏｌｕ　Ｃｒｅｇｇ　ＪＭ，Ｍｅａｇｈｅｒ　ＭＭ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｎ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｏｘｉｄａｓｅ—ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ｉｎ　ｆｅｄｂａｔｃｈ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９９７，２１：２７７—２８３．　［１５］　Ｂｒｉｅｒｌｅｙ　ＲＡ，Ｂｕｓｓｉｎｅａｕ　Ｃ，Ｋｏｓｓｏｎ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅ：ｂｏｖｉｎｅ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ［Ｊ】．Ａｎｎ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ，１　９９０，　５８９：３５０－３６２．　【１６】　Ｏｒｍａｎ　ＭＡ，（￣ａｈｋ　Ｐ，Ｏｚｄａｍａｒ　ＴＨ．Ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅｓ　ｏｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ｉｓ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｏｎ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：ａ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｍｕｔ。ａｎｄ　Ｍｕｔ　ｓｔｒａｉｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００９，　５２：２４５－２５５．　［１７］　Ｃｏｓ　Ｏ，Ｓｅｒｒａｎｏ　Ａ，Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ　ＪＬ，ｅｔ　ａ１．　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｍｕｔ　）ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｄｏｓａｇｅ　ｏｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ｆｅｄ—ｂａｔｃｈ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ】．Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，１１６：３２１—３３５．　［１８】　Ｐｌａ　ＩＡ，Ｄａｍａｓｃｅｎｏ　ＬＭ，Ｖａｎｎｅｌｌｉ　Ｌ　ｅｔ　ａ１．　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｕｔ　ａｎｄ　Ｍｕｔ。Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ　ｌｅｖｅｌ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｃＦｖ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｕｎｄｅｒ　ｆｅｅｄｂａｃｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ【Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｐｒｏｇ，２００６，２２：８８１—　８８８．