鱼类多倍体育种的研究

摘要：简述鱼类多倍体育种研究的简史和机制，重点介绍诱导多倍体鱼类的方法和鉴定多倍体鱼类的研究方法、步骤和原理，对多倍体鱼类的生长发育进行总结，综述多倍体鱼类在水产养殖上的应用和发展趋势。

关键词：三倍体 诱导 鉴定 过度繁殖 鱼肉品质

多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的，染色体加倍通过卵子第二极体的保留或受精卵早期有丝的抑制而实现。从群体，细胞，和分子水平的研究中，越来越多的资料表明，自然发生的多倍体，在群体遗传学和物种形成中有着十分重要的作用，鱼类多倍体育种在水产养殖上的应用和发展前景十分重要。

1·鱼类多倍体产生的机制

根据鱼类受精细胞学的研究，鱼类精子入卵的时间是在第二次成熟的中期，受精后放出第二极体。如果让卵子受精后，因受各种理化因子的刺激而不排出第二极体，亦即它们没有经过减数而形成所谓的二倍体卵核，然后与单倍体精核结合形成三倍体受精卵，而受精卵的第一次有丝受到抑制，则产生四倍体。 2·鱼类多倍体的育种的研究简史

关于人工诱导鱼类多倍体的研究，再早可以追溯到20世纪40年代，Makino 和Ojima曾以鲤鱼为材料以了解人工诱导动物多倍体的机制。他们提出：如果二倍体卵核与单倍体精核结合可能形成三倍体合子并进而产生三倍体个体。不久，Svardson（1945）用接近0℃的冷水处理受精后10分钟的白鲑以及大西洋鲑与褐鳟杂种卵约26小时而得到了少数三倍体囊胚。真正诱导鱼类三倍体成功的是Swarup，他不仅以低温诱导三棘刺鱼获得三倍体，而且饲养殖性成熟。后来，Purdom（1972）报道人工诱导海水经济鱼类鲽与川鲽杂种三倍体获得成功。到目前为止先后已在三棘刺鱼，鲽，川鲽，大菱鲆，菱鲆，鲤鱼，奥利亚罗非鱼，尼罗罗非鱼，草鱼，鳙鱼，等30多种鱼类诱导多倍体获得成功。

3·诱导多倍体鱼类的方法

人工诱导多倍体的方法有三种：生物学方法，物理学方法，化学方法。 3·1 生物学方法

生物学方法主要通过杂交方法尤其是种间杂交获得异源多倍体 3·1·1远源杂交

远源杂交，是指在分类学上物种(species)以上分类单位的个体之间交配。不同种间、属间甚至亲缘关系更远的物种之间的杂交。可以把不同种、属的特征、特性结合起来，突破种属界限，扩大遗传变异，从而创造新的变异类型或新物种。鱼类远缘杂交中，尤其是鲤科不同亚种之间的杂交，往往可以产生多倍体。Marian等（1978）最早发现草鱼♀×鳙♂之间的杂种是三倍体。后来，Beck等（1980）对草鱼、鳙及其F1的染色体组型进行了分析研究，结果发现草鱼与鳙具有二倍染色体数（2n=48），而F1全部具有三倍染色体数（3n=72）。以后，Beck等（1982）又发现，当草鱼♀与鳙♂杂交时，同时出现二倍体杂种与三倍体杂种，但35.1％的二倍体杂种畸形，而三倍体杂种的畸形率仅为5.1％。吴维新等（1981）在兴国红鲤♀和

草鱼♂的远缘杂交组合中获得过异源四倍体杂种鱼。刘思阳（1987）也证实草鲂杂种（草鱼♀×三角鲂♂）是异源三倍体，其中草鱼提供了两套染色体，三角鲂供了一套染色体。推测草鲂杂种染色体加倍的原因是受精过程中卵子核内有丝或第二极体的保留。 3·1·2 核移植

核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、并发育，让核供体的基因得到完全复制。陆仁厚等（1982）用四倍化的草鱼培养细胞（核）作为供体移植到泥鳅的会核卵内，曾获得心跳期的四倍体胚胎。如能对这种技术作进一步改善，它很可能是诱导鱼类四倍体较为有效的途径之一。 3·1·3 细胞融合

是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。应用这一技术，诱导鱼类囊胚细胞与囊胚细胞、囊胚细胞与未受精卵、囊胚细胞与受精卵或者受精卵与受精卵之间的细胞融合，在理论上应该产生三倍体或四倍体，但由于细胞内染色体发生重排，实际上得到的是含各种不同数量染色体的鱼类细胞群。例如，金志军等（1988）进行草鱼囊胚细胞与团头鲂受精卵之间的电融合试验，共用卵98个，其中73个发育至原肠胚（79.49％），65个发育至心跳期（66.33％），49个发育至仔鱼期（50％），染色体数目在 56～88之间，因此是嵌合体（chimera）。利用这一技术可以用来研究鱼类外源染色体对发育的影响和探索改良品种的可能性。

3·2物理学方法

物理学方法有三种：温度处理，静水压处理，电休克

3·2·1 温度处理又叫温度休克，包括热休克（heat shock）和冷休克（cold shock）对每一种鱼类来说，进行温度处理最重要的是必须确定处理的开始时间、持续时间以及温度高低。有证据表明，温度休克敏感性的差异既与遗传背景有关（Streisinger等，1981），也与卵子成熟度有关（Refstie等，1982），根据我们的经验，为了增加刺激强度，冷水性鱼类如鲑科鱼类，宜用热休克，温度范围为28～36℃，不能超过该种鱼类的致死温度；温水性鱼类如鲤科鱼类，宜用冷休克，温度范围为0℃左右。 3·2·2 静水压处理

静水压处理是新近发展起来的一种诱导鱼类多倍体的方法。最初，Streisinger等（1981）成功地用静水压阻止第二极体排出并用这种处理与乙醚相结合阻止第一次有丝而产生纯合二倍体雌核发育斑马鱼。后来，桂建芳等（1990、1991）采用静水压处理获得了批量三倍体和少数四倍体水晶彩鲫。日本山口县外海水产试验场高山繁昭等（1992）应用静水压处理已成功地较大批量地诱导出四倍体牙鲆稚鱼生长正常。其诱导条件是：水温 180C受精后 53min以650kg／cm2静水压处理 6min和水温 170C受精后 60min以 650kg／cm2静水压处理 6min。

虽然应用静水压处理比温度休克复杂，需要专门的设备，如水压机（hydraulic press），但处理的最佳条件易于掌握，处理程序易于标准化，且对胚胎的损伤比温度休克小。因此，静水压处理是进行鱼类染色体组操作的有效方法。 3·2·3电休克

Teskeredjic等（1993）报道用热休克与电休克（electric shock）相结合的方法诱导银大麻哈鱼三倍体获得成功。他们发现交流电（AC）诱导三倍体比直流电（DC）更有效。将受精后40min的卵置于 260C并给以 10min的交流电休克可得到100％的三倍体，而直流电休克和只有热休克而无电流休克处理的对照组分别为70％和15％。电休克装置是定做的，交流电与直流电的电压皆为10V 3·3 化学方法 3·3·1细胞松弛素

细胞松弛素（cytochalasin）是真菌类半知菌纲某些菌种的代谢产物。细胞松弛素对于活细胞具有干扰细胞质的特殊效应。Refstie等（1977、1981）以及Alien等（1979、1981）报道受精卵置于细胞松弛素B后产生了多倍体与二倍体嵌合体虹鳟和大西洋鲑。根据他们的试验，其浓度以10Pyml（溶解于0.1％二甲亚机水溶液中）为最好，从受精后30～40h0（积温）开始处理直至4细胞期为止。

国内虽有不少有关应用细胞松弛素B诱导软体动物（贝类）多倍体的研究报告，但还没有应用于鱼类的报道。另外，尽管细胞松弛素B诱导效果较好，但价格昂贵，且新近发现它是一种致癌剂，因此影响它的使用推广。

3·3·2秋水仙素

秋水仙素 （colchicine）是从百合科秋水仙属水仙（Colchicum autumnale）的器官中提取的一种植物碱，性极毒， 1934年开始应用于生物学研究，用它来抑制细胞时纺锤丝的形成。Smith等（1979）曾报道将第一次卵裂前的受精卵置于0.01％秋水仙素后产生了类似的多倍体与二倍体嵌合体美洲红点鲑。目前，秋水仙素被广泛用来诱导植物多倍体，但动物细胞经过秋水仙素处理后，往往会失去能力而趋向死亡，所以不常用。

3·3·3 聚乙二醇 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种常用的细胞融合剂。Ueda等（1986）用聚乙二醇处理过的虹鳟精子与卵子受精，结果得到高比例（1/3）的三倍体虹鳟胚胎。染色体组型分析表明，三倍体细胞具有两套父本染色体组而只有一套母本染色体组，从而证实它是由双精受精所致。造成双精受精的原因，据作者推测，可能是由于两个精子头部融合的结果，也可能是残留的聚乙二醇作用于卵膜，使得精子容许两个精子进入。上野雄一等（1993）进一步用30％～50％PEG（分子量为4000）融合鱼类精子，结果发现最大融合率为 18.5％（虹鳟）和 15.9％（长背鲫）。经 PEG处理的精子，其运动时间与未处理的相比较，虹鳟减低至 2/3，长背鲫减低至 1/2。

3·3·4． 6－二甲基氨基嘌呤

6－二甲基氨基嘌呤（6－imethylaminopurine，6－DMAP）是一种蛋白激酶抑制剂，是影响磷酸激酶作用的嘌呤毒素类似物。当6－DMAP与微管蛋白二聚体结合后，对微管的正常结构和功能起到了抗有丝的作用，因此可以产生三倍体。目前大有替代细胞松弛素B用来诱导贝类多倍体的趋势，但至今还没有应用于鱼类多倍体诱导的报道。

由于温度休克与静水压处理诱导鱼类多倍体效果较好，方法也较简便，

成本亦低，因此化学处理不可能是被选中的方法。不过，如能找出效果更好而且价格低廉的诱导剂，这种方法也是可以采用的。 4·鉴定多倍体鱼类的方法

由于处理并不是百分之百成功，而且处理过的群体中也可能是由多倍体、二倍体或嵌合体等混合组成，因此采用一个准确而又简便的方法来确定其染色体的信性就显得格外重要。根据文献报道，多倍体鱼可以用间接法（如核体积测量、蛋白质电泳、生化分析以及形态学检查等）和直接法（如染色体计数以及DNA含量测定等）加以鉴别，现分别介绍如下。 4·1核体积测量

按照一般规律，细胞核大小与染色体数目成正比例增加，而且为了维持恒定的核质比率，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。因此，组成多倍体的细胞及其细胞核通常要比二倍体大些。但多倍体的器官或躯体并不一定都比二倍体大，因为随着细胞大小增加而细胞数目相应减少，从而保持器官或躯体大小大致相等。

目前，红细胞的测量被广泛用来鉴定多倍体鱼，其中以核体积之比最为常用。总的来说，多倍体的红细胞要比二倍体的红细胞大得多。鱼类红细胞及其核是椭圆形的，其计算公式是：核面积（nuclear area）=a2·b·π／4，核体积（nuclearvolume）＝a2·b／1.91（Becak等，1967）。这里，a为短袖（minor axis），b为长轴（major axis）。

除红细胞外，也有用其他体细胞的，如脑细胞、软骨细胞、网膜细胞、上皮细胞、肝细胞以及肾细胞等的核体积来鉴定染色体倍性的，但要制作石蜡切片，比较费时。

4·2蛋白质电泳

蛋白质电泳也可用来鉴别多倍体鱼类。Balsano等（1972）用血清蛋白电泳图谱差异来辨别二倍体与三倍体亚马逊花绍（Poecilia formosa）。可是，刘秀美等（1978）发现二倍体与三倍体关东系银鲫（C．auratus langsdorfii）在血清蛋白上并没有明显的差异，她们用各种蛋白质或酶，如血红蛋白、肌浆蛋白、乳酸脱氢酶（LDH）、葡萄糖磷酸变位酶（PGM）以及磷酸葡萄糖异构酶（PGI）等进行反复电泳分析，最后找出肌肉肌浆蛋白（myogen）和肌酸激酶（creaine kinase）是鉴二倍体与三倍体关东系银鲫的最好标记。 4·3 生化分析

Sesaki对关东系银鲫二倍体与三倍体种群的肌肉与血液的化学组成进行了生化分析。发现两者肌肉的基本组成及蛋白质组成大体上一致，但三倍体具有较少的红细胞数量、较高的平均红细胞体积与平均红细胞血红蛋白。可是，两者血红蛋白，血细胞比容以及红细胞的丙酮酸激酶与磷酸果糖激酶的活性，三倍体也略高与二倍体，其比率分别为1·26和1·35 4·4 形态学分析

总的来说，三倍体与二倍体鱼类在形态上并没有什么差别，即使有差别也是不甚明显。例如，三倍体棘刺鱼与二倍体比较，仅躯干较短和尾部较长而已，可是在某些情况下，由于双亲基因剂量的差别，三倍体杂种可此较容易的与二倍体杂种相区别。例如，Pursom（1972）根据仔鱼色素细胞多寡能够区别三倍体和二倍体鲽和川鲽杂种，二倍体鲽呈现中等体色素而边缘鳍上完全没有色素细胞，二倍体杂种无论在身体还是鳍上都具有浓密的色素细胞，而三倍体杂种则介于两者之间。另外Beck（1983）用形态学分

析方法测定了二倍体和三倍体草鱼与鳙鱼杂种的26个形态与数量形状，结果发现其中的12个形状可以用来鉴别二倍体和三倍体，可靠度为97﹪但单个形状不能作为鉴别染色体倍性的指标。 4·5 染色体计数

染色体计数是鉴定鱼类多倍体的最准确的方法，但比较费时。目前染色、体标本的制备主要有细胞培养法，包括血液培养，肾细胞培养，鳞片培养，鳍培养以及胚胎培养等。处理程序是：首先采取组织和细胞，经过简单的处理，如用生理盐水冲洗干净和用胰酶消化等。然后将实验材料接种到培养液中恒温培养。在结束培养前2～6小时，在培养液中加入秋水仙素。然后经过低渗，固定，滴片，和染色，制成染色体标本。更简单的方法是，采用植物血球凝集素体内注射的方法，既不需要进行体外细胞培养，还能在较短时间内获得大量中期相，适用于野外和条件比较差的实验室。得到标本后，选择染色体数目完整、收缩适中和形态清晰的中期相进行显微镜照相并放大，然后将照片上的染色体一一剪下配对绘制染色体组型图。

4·6 DNA含量测定

细胞核内DNA含量是相当恒定的，即不同种类生物的细胞核内DNA含量尽管相差很大，但在同一种生物内，各种不同组织的细胞，不论他们的结构与功能有多大的差异，其细胞内的DNA含量基本是相同的，而且生殖细胞DNA含量恰是体细胞的1|2。可以通过细胞核内的DNA含量准确的确定其染色体倍性。在鱼类目前有两种测定细胞内DNA含量的方法：显微光密度测定法，流式细胞计数法。

5、多倍体育种存在的问题及在水产养殖上的应用

多倍体育种技术由于方法简便、见效快而具有潜在的理论和应用价值，国内外有关研究日趋深入和广泛，由此也许会产生更新更高的多倍体。但是在进行多倍体育种研究中还存在一些难点亟待解决：

5·1·1 处理时刻的确定。这主要体现在阻止第二极体放出诱导三倍体的起始时间和抑制第一次卵裂产生四倍体的起始时间。在诱导三倍体过程中，需要正确判断第二极体的排出时间，不同鱼类第二极体的排出时间是不同的。

5·1·2 诱导率的提高。如何采用较简便而实用的诱导方法，来获得高的诱导率和诱导量，同时如何保持多倍体成活率和孵化率也是需要亟待解决的问题。

5·1·3 准确可靠的倍性鉴定方法的确定。前面述及的倍性鉴定方法有许多种，其各有利弊，所以需要在此基础上探寻出一种既准确可靠又简单可行的鉴定方法。

5·2多倍体在水产养殖上的应用

从目前看来，多倍体鱼类对控制过度繁殖，增加幼鱼生长速度，延长成鱼寿命以及促进生长改善鱼肉品质等反面很大的作用。

总之，随着多倍体研究的深入，多倍体育种将为人类作出巨大的贡献。

参考文献：

[1]刘思阳·三倍体草鲂杂交与其双亲性腺发育的比较观察·淡水渔业·1988，（4）：27～28

[2]桂建芳等·染色体组操作的研究、静水压休克诱导三倍体水晶采鲫·水生生物学报·1990,14（4）：336～344

[3] Makino, S.(小野佐二郎)&Oqima,Y.(小岛吉雄).Formation of the diploid egg nucleus due to suppression of the second maturation division.indced by refrigeration of fertilixed eggs of the carp (Cyprinus carpio