〔12〕发明专利申请公开说明书
〔11〕CN 88101342A
〔51〕Int.CI4
C12N 5/02
〔43〕公开日1988年9月28日[21]申请号88101342[22]申请日88.2.9
[30]优先权
[32]87.02.09 [33]JP [31]211/87[71]申请人三井石油化学工业株式会社
地址日本东京都[72]发明人元山吉夫 木谷重和 松原浩一
[74]专利代理机构中国专利代理有限公司
代理人杨丽琴
权利要求书 1 页 说明书 17 页
[54]发明名称
植物的组织培养方法
[57]摘要
一种在液体培养基中进行植物组织培养的方法，它是在培养过程中，按规定的条件间歇地向培养基供给植物激素，以使培养能在具有高的细胞生长率的情形下长期稳定地进行。
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权 利 要 求 书
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1、一种用液体培养基进行植物组织培养的方法，其特征在于，培养过程中，在满足下述(a)和(b)两个条件的前提下向培养基间歇地供给植物激素：
(a)植物激素的供给间隔时间D定为细胞增加一倍所需时间的0.5～5倍。
(b)向培养基内供给的植物激素的量要满足式[Ⅰ]，即：10(A)/(D·W) ＜10[Ⅰ]
式中A表示向培养基间歇供给的植物激素的量(摩尔)，W表示培养区域内细胞的鲜重(克)，D表示供给植物激素的间隔时间(天)。 2、如权利要求1所述的植物组织培养法，其特征在于，当培养基中残存的植物激素的浓度大体为零的时候，间歇地向培养基供给植物激素。 3、如权利要求1或2所述的植物组织培养法，其特征在于，在培养过程中，将含有营养基质的、并已将所含基质调整到规定浓度的液体培养基连续地或间歇地供给培养区域，同时，又从培养区域的另一侧将培养液连续地或间歇地排出去，以便使培养在更新培养区域里的培养基的情况下进行。
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说 明 书
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植物的组织培养方法
本发明涉及植物的组织培养方法。更具体地说，本发明是一种在液体培养基中进行植物组织培养的方法，它是在培养过程中，按规定的条件间歇地向培养基供给植物激素，以使培养能在具有高的细胞生长率的情况下，长期稳定地进行。
在以往的组织培养方法中，即使在开始培养时使用了具有规定浓度的植物激素的培养基，但却没有尝试过在此以后，向培养基中额外追加植物激素等营养成份，来适当调整其浓度，以便连续进行培养。 在培养开始之后，培养基成份如植物激素被细胞所消耗，其浓度会逐渐降低，某些培养基成份的浓度会降到不利于继续培养的程度。采用以往的这种一次性投料培养方法，细胞的生长速度低，而且细胞生长的稳定性也差。
另一方面，还有一种已知的、将培养液与培养产物一起排出培养区域之外，然后更新培养基的连续培养方法，例如，在“发酵工艺学”第六十一卷，第117-128页（1983年）中，描述了一种烟草植物细胞的连续培养方法，这是一种不断更新含有植物激素2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）的液体培养基的连续培养方法。在这种情况下，培养期内，培养基中植物激素的浓度可认为几乎是恒定的。就更新培养基的培养方法来说，日本特公昭61-36915号公报中描述了一种悬浮细胞的高浓度培养方法，该方法是将培养液中细胞沉淀后所得到的上部澄清的培养液排出培养皿外，同时再加入新鲜培养基。然而，这些已有的培养方法，所培养的细胞的生长速度低，并且细胞的生长稳定性不令人满意，因此，由培养而获得的包括生物碱
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和色素在内的二次代谢产物的产量不足，大有改进的余地。 鉴于以上的背景技术，本发明人等探讨了与以往的培养方法相比，细胞的生长速度快、生长稳定性高、而且能高效率、高产量的生产二次代谢产物的培养方法;还发现，在培养期内，没有必要一定使植物激素维持恒定的浓速，而应该根据细胞的生长情况适当改变植物激素的浓度。基于这些见解，我们作出了能达到上述目的的关于组织培养方法的发明。 就是说，根据本发明，提供一种采用液体培养基进行植物组织培养的方法，该方法是在培养过程中，在满足下列条件（a）和（b）的前提下，间歇地向培养基中供给植物激素：
（a）植物激素的供给间隔时间D定为细胞增加一倍所需时间的0.5～5倍。
（b）向培养基内供给的植物激素的量要满足式〔Ⅰ〕： 10
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＜ (A)/(D·W) ＜10〔Ⅰ〕
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式中：A表示向培养基内间歇供给的植物激素的量（摩尔），W表示培养区域内细胞的鲜重（克），D表示供给植物激素的间隔时间（天）。 适宜采用本发明的植物组织培养方法的植物并无特别的，凡是以往的组织培养法可以进行培养的植物，基本上都可以用本发明的方法培养。这些植物包括：例如，澳洲毒茄属植物：如苦槛蓝（Duboisia myOporoides）、雷契哈迪（Duboisia leichhardtii）等;曼陀罗属植物：如阿拉伯曼陀罗（Datura
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tatula）、乔木曼陀罗（Datura arborea）、有刺曼陀罗（Datura Stramonium）等，莨菪属植物：如日本莨菪（Scopolia japonica）等;包括天仙子属（Hyos genus）植物如黑天仙子（Hyosoyamus niger）和颠茄属（Atropa genus）植物如颠茄雏菊（Atropa belladonna）等在内的茄科植物（Solanaceae）;黄莲属植物;如日本黄莲（Coptis japonica Makino）、水芹黄莲（Nakai）、菊黄莲（C.japonika Makino Var japonika）、小芹黄莲（C.japonika Makino Var. major Satake）、双黄莲（C.quinquefolia Miq.）以及三黄莲（C.trifolia Salisb）等;唐松草属植物如秋唐松（Thalictrum minus L.var.hypolecum Miq.）等;包括紫堇属（Thalintrige genus）植物和北美黄莲属（Hydrastis genus）植物等在内的毛莨科植物;罂粟科植物如罂粟（Papaver somniferum）等;豆科植物如甘草（Glycyrrhiza uralensis）;伞形科植物如胡萝卜、柴胡等;蓼科植物如掌叶大黄;夹竹桃科植物如萝芙木、日日草;茄科植物如烟草;紫草科植物如紫草;紫苏科植物如紫苏、薄荷等;茜草科植物如咖啡;玄参科植物如毛地黄等等。 在本发明中，上述植物的组织（包括细胞、器官）采用液体培养基来进行培养，所使用的液体培养基可以是以往公知的为植物组织培养所使用的培养基。具体地说，这种培养基是以无机成分、碳源及植物激素为必要成分，另外还含有维生素类，而且，如果需要还可进一步添加氨基酸类。所述培养基的无机成分包括含有如氮、磷、钾、钠、钙、镁、硫、铁、锰、锌、硼、钼、氯、碘、钴等元素的无机盐，具
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体地说，可举出钾、钠、铵、氯化铵、氯化钾、氯化钙、磷酸一氢钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸钠、硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、钼酸钠、氧化钼、碘化钾、硫酸锌、硼酸、氯化钴等化合物。
所述培养基的碳源包括，例如：碳水化合物如蔗糖及其衍生物;有机酸如脂肪酸;以及初级醇如乙醇等。
所述培养基的植物激素包括：例如，植物生长激素类如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、P-氯苯氧基异丁酸和2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）等;以及细胞动素类，如激动素、玉米素和苄腺嘌呤等。 所述培养基的维生素类包括：维生素H、硫胺（维生素B1）、吡哆醇（维生素B6）、吡哆醛、吡哆胺、泛酸钙、抗坏血酸（维生素C）、肌醇、烟酸、烟酰胺、以及核黄素（维生素B2）等。
所述培养基的氨基酸类包括，如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸以及赖氨酸等。
通常，本发明所使用的液体培养基中各种成分的最佳含量为：所述无机成分约为0.1微摩尔～100毫摩尔，所述碳源约为1克/升～100克/升，所述维生素类成分约为0.1毫克/升～150毫克/升，所述氨基酸类成分约为0～1000毫克/升。关于植物激素，尽管本发明是根据特定的条件将特定量的植物激素间歇地加入到培养基中的，然而，在即将间歇地添加植物激素之前，培养基中植物激素的浓度通常为零（即低于能检测出的最低极限）或接近于零。如有必要，此浓度也可在0～10
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摩尔的范围内。
另外，要根据下面所说的特定条件，将由下述公式〔Ⅰ〕确定的量的植物激素间歇
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地供给到培养基中去，这样，在刚刚间歇地向培养基添加植物激素之后，培养基内的植物激素的浓度一般在10～100摩尔的范围内。
本发明所使用的培养基，通常可以是植物的组织培养用的公知的培养基，例如，由下列程序配制的培养基，即将上述碳源添加到莫拉西盖-斯库格（Murashige & Skoog）（′62）的培养基、林斯麦耶-斯库格（Linsmaier & Skoog）（RM-1965）的培养基、怀特（White）（′63）的培养基、根堡（Gamborg）的B-5培养基、以及三井的M-9培养基中，如果需要，还可进一步添加上述植物激素、维生素类和氨基酸类。对于本发明，特别以使用由上述这些培养基中的林斯麦耶-斯库格或莫拉西盖-斯库格的培养基所调制成的培养基为最佳。上面所举出的这些公知的培养基的成分，在1979年由朝仓书店出版的，竹内、中岛、古谷三人所著的“新植物组织培养”一书中，第386-391页中有记载。 根据本发明，当采用上述液体培养基对上述植物进行组织培养时，要根据体现了本发明的特征的下列条件来实施。下面详细叙述所说的条件。
在本发明的植物组织培养方法中，细胞在液体培养基中的浓度可以是任意的，但相对于液体培养基来说，以细胞浓度为100～500克/升为佳，特别以200～400克/升的范围为最佳。当在此条件下进行培养时，培养皿的单位容积的细胞产量高，因而，培养的效率高。 通常，当细胞浓度超过500克/升时，由于浓度高，呈浆状，培养液的搅拌、混合不够充分，阻碍了有效地供应氧气，因此，会引
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摩尔之间，最好在10～1
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起培养过程中细胞的坏死，使得细胞很难正常地生长。而且，如果为了供氧充分而进行剧烈的搅拌的话，会发生细胞破坏或损伤等情形，培养很困难。正因为当细胞浓度在超过500克/升的情况下，不利于培养，所以，以细胞浓度在低于500克/升的状态下进行培养为佳。在培养过程中，由于细胞的数量随细胞的生长而增加，因此本发明要根据需要，在培养期间内用适宜的方法把适当数量的细胞排放到培养区域之外，以使培养区域内的细胞浓度能维持在适宜的水准。此外，用来计算细胞浓度的细胞重量系指细胞在湿状态下所测得的鲜重。此处所指的鲜重，通常用下述方法求得：即将培养物的组织放在蒙有滤布的瓷制漏斗中，用喷水泵过滤5分钟，以滤去除细胞以外的培养液，测量所剩细胞的重量。此法所收得的细胞的含水率，视植物种类的不同而不同，通常以重量计为80～95%。
本发明中的组织培养是培养植物的组织碎片或细胞。所说的组织碎片包括：如茎梢、茎、叶、花、种子和根的组织碎片，由组织碎片诱导所生的愈合组织和培养的细胞，也可以用作组织培养的原料。 本发明的组织培养法，既可以用于一次性投料培养，也可以用于连续培养，但最适于连续培养。在连续培养的情况下，组织培养可按下列步骤进行：将含有营养基质的、并已将基质调整到规定浓度的液体培养基连续地或者间歇地供给培养区域，同时，又从培养区域的另一侧连续地或间歇地把培养液排出，这样就能在不断地更新培养区域内的培养液的情形下进行组织培养。培养液的更新既可以是连续的，也可以是断续的。
此处所谓的营养基质，就是上面说过的本发明所使用的液体培养基的培养成分，包括无机成分、碳源、植物激素、维生素和氨基酸。
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所谓含有营养基质的并已将基质调整到规定浓度的培养液是指含有上面提到过的无机成分约为0.1微摩尔～100毫摩尔，碳源约为1～100克/升，维生素类约为0～150毫克/升，氨基酸约为0～1000毫克/升的液体培养基。在不断更新液体培养基进行连续培养的情况下，供给培养区域的液体培养基中的植物激素的浓度，通常以零为佳（即低于能检测出来的界限）。但是，如有必要，也可以在0～10
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摩尔的范围之内。正如
上面所述，在刚刚间歇地向培养区域添加了植物激素之后，培养区域内的植物激素的浓度，通常在10～10
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摩尔范围内，最好在10～10摩
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尔的范围内。在本发明中，供给培养区域的、含有培养基成分的、且这些成分已调整到上述浓度范围内的液体培养基，一般以使用新鲜的液体培养基为好，但也可以把从培养区域排放出来的培养基中的营养基质的浓度进行调整，然后循环使用。在循环使用的情况下，最好适当地除去培养液中的细胞代谢后所生成的废物。
根据本发明，当在不断更新培养液的情况下进行组织培养时，以满足下面公式为最佳：μ≤ (F)/(V) ＜20μ，式中：V表示培养皿（培养区域）内培养液的量（升），F表示供给培养皿的液体培养基的量（升/天），F/V表示培养基的更新率，而μ则表示组织培养物的相对生长速度（天）。此处的相对生长速度μ（天）是根据下述方法来确定的。 在不把培养的细胞排出培养区域外的情况下，相对生长速度μ由下面公式确定：
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式中，Xo表示培养期间to时刻细胞的量，Xt则表示经过一段时间t（天）之后细胞的量。
在维持细胞的量为Xo而将生长的细胞排出培养区域之外的情况下，相对生长速度由下面公式确定： μ＝ (Yt)/(Xo·t)
式中，yt表示经过t时间（天）后排出培养区域的细胞的量。因此，μ所具有的物理意义是其量纲为时间的负一次幂（天），μ值越大，表示组织培养物的生长越快。
本发明中的相对生长速度μ的值随植物种类的不同而不同，一般在0.02～0.4（天），最好是在0.05～0.2（天）的范围内进行组织培养。根据本发明，在采用连续培养法的情况下，前面已经说过，连续地或断续地供给培养区域的、含有营养基质的、且所含基质已调整到了规定浓度的液体培养基的供给量F（升/天）最好满足公式：μ≤F/V＜20μ。这时，培养基更新率F/V的值一般在0.02～8（天）的范围内，最好在0.05～4（天）的范围内。
在本发明中，当连续地或断续地从培养区域的另一侧排放培养液时，在培养过程中，以使培养皿内的细胞浓度维持在100～500（克/升）范围内为佳。培养时可以只从培养皿中排出培养液，当必
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要时，也可以将适量的细胞和培养液一起排出。
在本发明中，当培养基的更新率（F/V）小于相对生长速度μ，即F/V＜μ时，细胞的浓度会变得过高，而且，细胞浓度不能保持最佳值，因此，最好是从培养区域排出的培养液中含有适量的培养细胞，而不是只排出培养液。例如，培养中，在从设置在培养皿上的排放管排放含有细胞的培养液的同时，把含有营养基质的、并且所含基质已调整到上述规定浓度的液体培养基输入培养皿中，以使培养皿里的细胞浓度保持在适当值。
在本发明中，当采用连续培养法时，若培养基更新率（F/V）比相对生长速度μ高得太多，即20μ≤F/V时，通常很容易出现如细胞黑化、坏死等不良现象。因此，在进行组织培养时，最好把培养基更新率（F/V）控制在满足公式μ≤F/V＜20μ的范围内。
在本发明中，从培养区域的另一侧连续地或者断续地排出的培养液的量，一般与上述向培养区域供应的培养基的量F（升/天）相当，但并非一定要限定在F这个量，例如，在上述的F/V＜μ的条件下培养时，培养基的排出量就可以比供给量F（升/天）的值稍大一些。 如前所述，在本发明中，培养时要在满足下面的（a）和（b）条件的前提下，向培养基中间歇地供给植物激素：
（a）植物激素的供给间隔D（小时）定为细胞增加一倍所需的时间的0.5～5倍。
（b）供给培养基的植物激素的量要满足〔Ⅰ〕式： 10
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＜ (A)/(D·W) ＜10〔Ⅰ〕
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式中：A表示间歇地加入培养基中去的植物激素的量（摩尔），W表示在培养区域内的细胞的鲜重（克），D表示供给植物激素的间隔时间（天）。
下面详细阐述本发明的供给植物激素的方式。在本发明中，实施时不但要将满足条件（b）中的式〔Ⅰ〕的上面说过的植物激素的量（A）间歇地加入培养基中，而且还要象上面条件（a）中所说的那样，供给植物激素的间隔时间D要为培养区域内细胞增加一倍的时间（doubling time）的0.5～5倍。此处所谓的细胞增加一倍时间，是指在目前所讨论的培养区域内，正在生长的细胞的量增加一倍时所需要的时间，这个增加一倍时间，根据具体的植物种类和培养条件的不同而不同，一般为2-20天。在本发明中，当间歇地供给植物激素的时间间隔D不到细胞增加一倍时间的0.5倍时，就和连续地供给激素的情形一样，随着培养时间的延续，会出现细胞黑化和坏死的现象，从而严重阻碍细胞的生长。另一方面，当供给植物激素的时间间隔D超过细胞增加一倍时间的5倍时，由于每一次所供给的植物激素的量太多了，以致，在刚供给过植物激素之后，可能会从细胞中排泄出二次代谢产物或者由于激素的紊乱，可能出现细胞生长暂时发生障碍等，难以实行长期稳定地培养。由于上述两种条件都是不适宜的，所以间歇供给植物激素的时间间隔应在上面所说的范围内。
虽然，上面式〔Ⅰ〕所示的植物激素的量（A）是间歇地供给培养基的量，但在本发明中，进行培养时，在刚向培养基内间歇添加过植物激素之后，培养基中的植物激素浓度应如前所述，一般应在10～10摩尔的范围内。所以，间歇地供给培养基的植物激素的量（A），在满足〔Ⅰ〕式的同时，还应当使培养基中植物激
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素的浓度在刚刚间歇地添加了植物激素之后，处于上面所述的10～10
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摩尔的范围之内（培养基中植物激素的浓度由间歇供给的植物激素与供给前培养基中残存的植物激素相加的总量而定）。因此，在确定添加植物激素的量（A）时，除了满足式〔Ⅰ〕之外，还应考虑到培养基中残存的植物激素的量。并且在本发明中，采用这样的方法，即当培养基中残存的植物激素的浓度实质上为零时，在满足上述（a）和（b）条件的情况下，间歇地向培养基中供给植物激素，使植物激素的浓度落入上面所说的范围，这样就能保持细胞从→长大的正常循环，并使细胞的生长和二次代谢产物的生产能长期稳定地进行下去，达到理想的效果。不用说，如果需要，当培养中残存的植物激素浓度实质上不等于零，而是在上面提到的范围内的任意一个浓度时，本发明仍可以采用在满足上面的（a）和（b）条件的前提下，间歇地供给植物激素的方法。 在本发明中，当上面的〔Ⅰ〕式中A/D·W的值低于10
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时（即间歇
添加的植物激素的量少），细胞的生长速度减慢，而且细胞的生长也不充分，达不到理想的效果。而当该值高于10时，培养基中植物激素的浓度过高，会引起细胞坏死，而且，二次代谢产物的产量显著下降，所以，本发明中，间歇添加的植物激素的量应在上述范围内。 本发明的组织培养法，能高效率地获得二次代谢产物，例如小檗碱、颠茄碱、莨菪胺等生物碱，以及莽草宁、纯嘌呤、茜素等色素成分。 采用本发明的按照特定的条件向培养基间歇地供给植物激素的组织培养法，由于细胞的生长速度比以往的方法快，而且细胞生长的稳
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定性良好，所以能有效地获得高产量的二次代谢产物。 下面用实施例具体说明本发明。 实施例1
采用林斯麦耶-斯库格培养基，在2升的通气搅拌型培养皿内培养日本黄莲细胞（Coptis japonica）。培养过程中，培养皿内的液体培养基的体积为1.8升。黄莲细胞的浓度以鲜重计为300克/升，将含有营养基质的、且基质已调整到规定浓度的液体培养基以540毫升/天的量连续地供给培养皿，同时，每隔4日（等于细胞增加一倍的时间）添加一次激素成分（萘乙酸9×10摩尔和苄腺嘌呤9×10摩尔），并且，从培养皿的另一侧排出培养基和生长的细胞，以此来实施培养。 经过六十天的连续培养后，黄莲细胞的相对生长速度为0.18（天），黄莲细胞中的小檗碱的含量为5.0%。 实施例2
重复实施例1的步骤，只是在将含有营养基质的、已将所含基质调整到规定浓度的液体培养基以540毫升/天的量连续地供给培养皿的同时，每隔12天（细胞增加一倍时间的3倍）添加一次激素成分（萘乙酸3×10
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摩尔和苄腺嘌呤3×10摩尔）。培养结果，黄莲细胞的相对生长速度
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为0.17（天 实施例3
），黄莲细胞中的小檗碱的含量为4.9%。
实施例1的步骤中，除了在将含有营养基质的且已将所含基质调整到规定浓度的液体培养基以540毫升/天的量连续地供给培养皿的同时，每隔18天添加一次激素成分（萘乙酸4×10摩尔和
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苄腺嘌呤4×10摩尔）之外，其余步骤均与实施例1相同。培养结果，黄莲细胞的相对生长速度为0.16（天），黄莲细胞中小檗碱的含量为4.7%。 比较例1
实施例1的步骤中，除了在将含有营养基质的、已将基质调整到规定浓度的液体培养基以540毫升/天的量连续地供给培养皿的同时，每隔二十一天（细胞增加一倍时间的5.3倍）添加一次激素成分（萘乙酸5×10摩尔和苄腺嘌呤5×10摩尔）之外，其余步骤均与实施例1相同。这时，随着培养时间的延续，黄莲细胞的相对生长速度和细胞中小檗碱含量逐渐降低。经六十天培养后，相对生长速度和小檗碱含量分别为0.08（天）和2.0%。 比较例2
实施例1的步骤中，除了在将含有营养基质的且已将所含基质调整到规定浓度的液体培养基以540毫升/天的量连续地供给培养皿的同时，每隔4天（等于细胞增加一倍的时间）添加一次激素成分（萘乙酸5×10
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摩尔和苄腺嘌呤5×10摩尔）之外，其余步骤均与实施例1相同。这时，
出现了培养细胞的黑变（坏死），经三十天培养之后，相对生长速度和小檗碱的含量分别为0.05（天）和1.5%。 比较例3
实施例1的步骤中，除了在将含有营养基质的且已将基质调整到规定浓度的液体培养基以540毫升/天的量连续地供给培养皿的同时，每隔8小时（细胞增加一倍时间的0.08倍）添加一次激素成分（萘乙酸10摩尔和苄腺嘌呤10摩尔）之外，其余步骤
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均与实施例1相同，培养7天之后，开始出现愈合织织的黑化，培养三十天后，相对生长速度及小檗碱的含量分别为0.10（天）和2.5%。 比较例4
实施例1的步骤中，除了在将含有营养基质的且基质浓度已调整到规定浓度的液体培养基以540毫升/天的量连续地供给培养皿的同时，每隔4天（等于细胞增加一倍的时间）添加一次激素成分（萘乙酸10摩尔和苄腺嘌呤10
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摩尔）之外，其余步骤均与实施例1相同。培养结果虽
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未发现细胞的黑化和坏死，但细胞的生长慢，相对生长速度为0.11（天
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），小檗碱含量为5%。
实施例1-3和比较例1-4的数据如表1所示。 实施例4
采用林斯麦耶-斯库格培养基，在容量为2升的通气搅拌型培养皿内培养烟草的培养细胞（Nicotiana tabacum）。培养过程中，培养皿内的液体培养基的体积为1.8升，烟草细胞的浓度以烟草细胞的鲜重计为211（克/升），将含有养基质的并已将营养基质调整到规定浓度的液体培养基以600毫升/天的量连续供给培养皿，同时每隔2天（等于细胞增加一倍的时间）添加一次激素成分（2，4-二氯苯氧乙酸4×10摩尔），并且从培养皿的另一侧排出培养基和生长的细胞。经过六十天的连续培养后，烟草细胞的相对生长率为0.38（天）。 实施例5
采用莫拉西盖-斯库格培养基，在容量为2升的通气搅拌型培养皿中培养茜草（Rubia cordifolia）的培养细胞。在培养过
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程中，培养皿内的液体培养基的体积为1.8升，茜草细胞的浓度以茜草细胞的鲜重计为138克/升，将含有营养基质的、并已将基质调整到规定浓度的液体培养基以600毫升/天的量连续供给培养皿，同时每隔6天（等于细胞增加一倍的时间）添加一次激素成分（苄腺嘌呤1.1×10摩尔，2，4-二氯苯氧乙酸1.1×10摩尔），并且，从培养皿的另一侧排出培养基和生长的细胞。经过六十天的连续培养后，茜草细胞的相对生长速度为0.11（天），蒽醌类的含量为1.1%。 比较例5
实施例4的步骤中，除了每隔十二天（细胞增加一倍时间的6倍）添加一次激素成分（2，4-二氯苯氧乙酸2.4×10摩尔）之外，其余均与实施例4相同。培养结果是，烟草细胞的相对生长速度为0.29（天）。 比较例6
实施例5的步骤中，除了每隔0.6天（细胞增加一倍时间的0.1倍）添加一次激素成分（苄腺嘌呤1.1×10摩尔，2，4-二氯苯氧乙酸1.1×10摩尔）之外，其余均与实施例5相同。培养结果是，茜草细胞的相对生长速度为0.05（天）蒽醌的含量为0.7%。 实施例4-5和比较例5-6的数据如表2所示。
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