高分子纳米药物根据其制备原料的来源可分为两大类:
第一类为基于天然存在的高分子
材料制备的纳米药物， 包括基于蛋白质类： 胶原（Collagen），白蛋白（Albumin ），明胶（Gelatin） 以及聚多糖类： 琼脂糖（Agarose）,透明质酸（HA ）,葡聚糖（Dextra n）,壳聚糖（Chitosa n） 和环糊精（Cyclodextrins ）等天然材料制备的纳米药物，如：白蛋白结合型紫杉醇（
纳米药物Abraxane在2005年被批准用于治疗转移性胰腺癌和肺癌；
PTX ）
CRLX-101是基于环糊
精的喜树碱纳米药物，目前在临床二期研究阶段。第二类是基于人工合成的高分子材料制备 的纳米药物，包括基于聚（丙交酯
-乙交酯）（PLGA ）、聚乳酸（PLA ）、聚乙交酯（PGA ）、
聚己内酯（PCL）、聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（ PVA）、聚磷酸酉旨 Poly（phosphoesters）、聚 氰基丙烯酸烷基酯（PACAs）、聚原酸酯（POE）、聚酰胺 Poly（amides）、聚酯酰胺（PEAs） 以及聚氨基酸 Poly（amino acids）等制备的纳米药物，如: PEG化的脂质体阿霉素（DOX ）
Doxil于1995年被US FDA批准上市，用于治疗乳腺癌、卵巢癌、骨髓瘤以及艾滋病相关 性卡波西肉瘤；基于 PEG-PLA的PTX纳米药物 Genexol-PM于2007年在韩国被批准用于 乳腺癌、肺癌以及卵巢癌的治疗；NC-6004 （Nanoplatin）是基于PEG-PGA的顺铂纳米药物， 正处于临床一期研究阶段，另外其用于胰腺癌的临床三期实验也在进行中；
NK911是基于
Poly（ethylene glycol）-b-poly（aspartic acid） （PEG-PAA） 的 DOX 前药纳米药物；基于 PEG-PLA 的主动靶向性多西他赛 （DTX ）纳米药物 BIND-014靶向到前列腺特异性膜抗原 ，
用于治疗前列腺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、膀胱癌以及头颈癌的研究处于临床
II期。 （PMSA ）
基于人工合成的高分子纳米药物由于其化学性质稳定、可规模化生产、便于化学修饰， 在癌症的治疗中取得了令人振奋的成果。 得纳米药物的制备具有较高的可重复性。
人工合成的高分子具有较高的均一性以及纯度，
使
在众多的合成高分子材料中， PLGA由于具有良好
的生物相容性以及生物可降解性，被广泛应用于生物组织工程以及抗癌药物输送体系。 1基于PLGA的纳米抗癌药物的制备
PLGA是众多聚合物中在生物医学领域应用最为广泛的一种合成高分子材料。 有优异的生物相容性和生物可降解性，被 备多种药物的体内递送系统。
由于其具
US FDA和欧盟医药管理局（EMA ）批准用于制
PLGA由丙交酯和乙交酯两种单体在辛酸亚锡或者异丙醇铝等催化剂的催化作用下通 过无规开环共聚制备得到。丙交酯和乙交酯单元通过酯键连接在一起， 交酯和乙交酯的比例可得到组成不同的聚合物，例如
在聚合过程中调节丙
50%的丙
PLGA 50:50 （表示聚合物由
交酯和50%的乙交酯构成），PLGA 75:25、PLGA 85:15等。PLGA的降解主要是聚合物链中
酯键的水解引起的，不同分子量以及单体比例的 年不等。通常丙交酯含量较低的低分子量
PLGA的降解时间为几天到几个月甚至几
PLGA的降解速率较快，可能是因为乙交酯的亲
水性较强，容易吸收大量的水分， 促进聚合物的降解。 另外聚合物末端的基团也会影响其降 解的速率，羧基封端的 PLGA的降解速率快于羟基封端的
PLGA。通过调节 PLGA的分子
PLGA通过水解产
量、丙交酯和乙交酯的比例以及其末端基团可以控制聚合物的降解速率。 生两种代谢产物：乳酸和羟基乙酸（
Figure 1.3），这两种分子在体内通过 Krebs循环被代谢
掉，不会产生任何系统副作用，保证了体内使用的安全性。
PLGA
IMibcW PathMiy*
Figure 1.3 Structure and hydrolysis of PLGA.
1.1常规PLGA纳米药物
采用不同的制备方法，可以实现 PLGA纳米载体对多种药物，包括小分子亲水或疏水
DNA和RNA的包载。此外，通过使用不同 PLGA制备的纳米抗癌药物，可以实现对药
药物、大分子蛋白类药物、生物类的核酸药物 单体比例组成、不同分子量或者不同末端基团
物的控制释放。PLGA纳米粒子主要通过乳化-溶剂挥发法、乳化-溶剂扩散法、乳化-反向盐 析法、透析法、喷雾干燥法以及纳米沉淀法制备得到。 程、使用条件以及优缺点。
孚L化-溶剂挥发法包括单乳化法和双乳化法两种，单乳化（水包油）法：将 物共同溶解在具有挥发性的有机溶剂，
PLGA和药
接下来将详细介绍每种制备方法的过
如二氯甲烷、氯仿或者乙腈中，然后将该溶液加入到
持续搅拌的包含有表面活性剂，如聚乙烯醇
（PVA）、吐温80、泊洛沙姆188或者维生素E
聚乙二醇琥珀酸酯 （Vitamin E-TPGS）的水溶液中，产生稳定的乳液。随后通过升高温度、 降低压力或者持续磁力搅拌的方法将有机溶剂除去，适用于制备包载亲脂性药物分子如
PTX、DTX、DOX等。双乳化（水包油包水）法：将药物溶解在去离子水中并且滴加至强 力搅拌的溶解有 PLGA的挥发性有机相中，形成油包水的初始乳液，随后将该乳液加入到 水溶液中经磁力搅拌形成最终的乳液，
最后将有机溶剂通过挥发法除去，
适用于包载亲水性
乳化-:
药物，如小分子甲氨蝶呤二钠（ MTX 2Na）、蛋白类药物，如胰岛素以及疫苗等。
溶剂扩散法：通过高速匀浆将溶解有聚合物和药物的有机相在含有表面活性剂的水溶液中进 行乳化，有机相和水相在室温条件下形成互相饱和的热力学平衡体系，
随后在均匀搅拌下加
入大量的水形成胶体纳米粒子，通过挥发或者旋蒸的方法除去有机溶剂。 该方法制备的纳米 粒子具有以下优点：药物包载率高、可重复性强、易于量产、纳米粒子分布窄、制备简便。 缺点主要是对水溶性的药物包载不理想，容易泄露并且需要除去大量的水。 盐析法：将聚合物和药物同时溶解在与水互溶的有机溶剂中， 解有盐析试剂和乳化剂的水溶液中，
孚L化-反反向
随后将其加入到强力搅拌的溶
形成水包油的乳液。 随后加入大量的水， 挥发性有机溶
剂将会扩散至水相中，促进纳米粒子的形成。残留的有机溶剂以及盐析试剂通过过滤的方法 除去。该方法适用于对热不稳定的药物如蛋白质、 以制备粒径较小且分布较窄的纳米粒子。
DNA、RNA的制备。透析法：透析法可
将聚合物溶解在挥发性的有机相中，
随后将其转入
透析袋中，透析袋中的有机相将被置换为水， 聚合物的溶解性降低， 逐步聚集最终形成均一
的纳米粒子溶液。 喷雾干燥法：该方法可以作为制备聚合物纳米粒子的常规方法的替代。 在制备的过程中，油包水的分散液经过热空气流喷射形成纳米粒子。 缺点是纳米粒子将会粘附在干燥喷雾器的内壁， 又称溶剂置换法，这种方法简便易操作，
该方法制备纳米粒子的
纳米沉淀法：
降低了纳米粒子的回收效率。
只需一步操作，适用于包裹疏水性的药物分子。将
如丙酮、乙醇、甲醇或者乙腈中，将有机
有机溶剂快速地扩散出来， 形成纳米
聚合物和药物分子溶解在与水互溶的极性有机相，
相逐滴滴加到含有乳化剂或者表面活性剂的水溶液中， 粒子。
很多研究表明 PLGA纳米粒子一旦经尾静脉注射进入体内后会与血液中存在的调理素 蛋白结合，随后被巨噬细胞吞噬， 最终纳米粒子将会通过人体的网状内皮系统 为了避免PLGA纳米粒子被RES清除，研究人员设计了不同的策略对
（RES）清除。
PLGA纳米粒子进行
表面改性。在 PLGA纳米粒子的表面覆盖一层亲水性的分子或者利用生物体内本身存在的 物质将PLAG纳米粒子 伪装”成体内的内源性物质，可以有效避免 的清除。
1.2 PEG改性的PLGA纳米药物
PEG 是最常用于纳米粒子表面改性的亲水性聚合物，其具有优异的生物相容性。 PEG RES对PLGA纳米粒子
化作用能够有效地降低纳米粒子与血液中蛋白的结合， 内循环时间，从而增加纳米药物在肿瘤组织的富集。将 方法，一种是通过化学键直接将
显著提高纳米粒子的稳定性、 延长体 PLGA纳米粒子表面 PEG化有两种
PEG与PLGA键合在一起，制备双亲性的聚合物如
PEG-PLGA、PLGA-PEG-PLGA 或者PEG-PLGA-PEG，然后通过聚合物的自组装形成 PLGA
为核PEG为壳的纳米粒子。例如， Haddadi报道了一种由两嵌段聚合物 PEG-PLGA通过在
水溶液中组装形成的 PLGA纳米粒子(PLGA-PEG NPs )。装载DTX后纳米粒子显著延长了 药物的半衰期，其t 1/2分别是PLGA包载的DTX以及自由DTX的2.62倍和3.69倍。Chen 报道了 PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物胶束包载穿心莲内酯 送。胶束包载的ADG具有更高的生物利用率， 和血浆平均停留时间分别提高了 的生物利用度。此外，载药胶束对
(ADG )，用于药物的细胞内递
相对于自由ADG，其药时曲线下面积(AUC)
2.7倍和2.5倍，说明包载 ADG的胶束极大地改善了药物 MDA-MB-231细胞表现出了较强的细胞增殖抑制作用以
PEG的两亲性聚合物与 PLGA通过共组装
及促进细胞凋亡的效果。另外一种方法是将含有
或者后修饰的方式包被在 PLGA纳米粒子的表面。Zhang等报道了由PLGA、二硬脂酰磷脂 酰乙醇胺(DSPE )与mPEG-DSPE通过一步纳米沉淀法制备的纳米粒子(
PLGA-Lipid-PEG
NP)(Figure1.4)。同时制备了由 PEG-PLGA自组装形成的 PLGA-PEG NP以及表面未经过修 饰的PLGA纳米粒子PLGA NP作为对照组。在含有 10%人血清白蛋白的介质中孵育 后，PLGA-Lipid-PEG NP 以及PLGA-PEG NP粒径基本保持稳定，
60min
而PLGA NP的粒径从90
nm增大至200-300 nm。将PEG修饰在PLGA纳米粒子表面后，显著减少了纳米粒子对蛋 白的吸附，增强了其在血液中的稳定性。
Figure 1.4 Developme nt of lipid polymer hybrid nano particles (NPs). (A) Schematic illustrati on shows the formulation of lipid polymer hybrid NPs. The NPs comprise a hydrophobic PLGA (polylactic-co-glycolic acid) core, a hydrophilic PEG (polyethylene glycol) shell, and a lipid (lecith in) mono layer at the in terface of the hydrophobic core and the hydrophilic shell. (B) Tran smissi on electro n microscopy (TEM) image dem on strated the structure of the hybrid NPs proposed in (A).
Vitamin E-TPGS是一种水溶性的 PEG衍生物，在制备PLGA纳米粒子时通常被用做表 面活性剂，不仅可以增强
PLGA纳米粒子的稳定性而且可以增加对药物的包载效率。
Feng
报道了 Vitamin E-TPGS孚L化制备的PLGA纳米粒子用于抗癌药物 DTX的高效包载以及肿瘤 递送，PLGA-b-TPGS对DTX的包载效率为 85.91%，明显高于 PLGA(78.36%)，并且具有较
强的抑制细胞增殖的能力其半数抑制浓度(
IC50 )为0.33冯/mL相对于自由DTX其细胞毒
性提高了 32倍。
1.3多糖及蛋白改性的 PLGA纳米药物
将生物相容性良好的天然聚多糖包括
HA、Dextran、Chitosan 等，以及一些人体内的内
源性物质如人血清白蛋白( HSA)修饰到 PLGA 纳米粒子的表面也可以改善其表面性质， 降低蛋白吸附，延长纳米药物的循环时间提高抗肿瘤效果。例如, 聚物Dex-PLGA 制备的胶束包载 PTX用于肿瘤的递送。
Du报道了基于两亲性共
Dex-PLGA/PTX 相对于自由 PTX，
对多种癌细胞如SKOV-3、0VCAR-8以及MCF-7细胞表现出较强的抗细胞增殖作用。此外， 该载药胶束显著提高了药物的体内最大耐受剂量
(MTD > 200 mg PTX/kg )，相对于自由PTX
提高了 8倍。体内抗肿瘤实验结果表明， Dex-PLGA/PTX能够有效抑制肿瘤的生长以及显著 降低药物的毒副作用，而且在高剂量药物作用下可以完全消除肿瘤。
Dinarvand报道了 HSA
表面修饰过的PLGA纳米粒子，能够有效地将 PTX运送至T47D乳腺癌细胞中。当 PTX浓 度为15 nM时，细胞的存活率为 43%，细胞杀伤力明显强于自由 PTX纳米粒子。
PTX、未经HSA修饰的载
1.4细胞膜 “伪装”的的PLGA纳米药物
伪装”的PLGA纳米药物，不仅
提高癌细胞对纳米粒子
将细胞膜包被在 PLGA纳米粒子表面制备得到细胞膜
能够显著延长药物的循环时间， 而且可赋予纳米粒子主动靶向功能，
的摄取量，进而增强 PLGA纳米药物的抗肿瘤治疗效果。近些年来，研究者们制备了不同 细胞膜，主要包括红细胞膜、癌细胞膜、血小板膜伪装的
PLGA纳米药物用于多种癌症的
治疗。其制备过程主要包含细胞膜的提取、纳米粒子的制备以及细胞膜和纳米粒子的融合。 例如，Figured 5是红细胞膜(RBC)包被的PLGA纳米药物的制备流程图， 的PLGA纳米粒子的循环时间极大地得到延长，
RBC膜伪装”
为39.6 h,经过PEG进行表面修饰后的 PLGA
纳米粒子的循环时间为 15.8 ho Zhang报道了乳腺癌 MDA-MB-435 细胞膜包被的 PLGA纳 米粒子，显著提高了其对
MDA-MB-231 细胞的主动靶向能力。该纳米粒子能够高效的被
MDA-MB-435细胞摄取，摄取量分别是PLGA纳米粒子的40倍和红细胞膜包被的 PLGA纳 米粒子的20倍。Liu 报道了 RBC 包被 的包载 四氟化碳的PLGA 纳米粒子 (PFC@PLGA-RBCM ),经过RBC包被之后，PLGA纳米粒子的稳定性明显得到提高，而 且极大地延长了体内循环时间。 PFC具有极高的溶氧气能力，相对于未经过
RBC包被的
O2
PLGA纳米粒子(PFC@PLGA ) , PFC@PLGA-RBCM 能够以一种更具有持续性的方式将 释放出。通过 TEM可以观察到 PFC@PLGA-RBCM 的结构在释放 O2前后没有发生明显地
变化。药代动力学研究表明， PFC@PLGA-RBCM 具有较长的体内循环时间，约为 相对于他们之前报道的白蛋白包被的
PLGA纳米粒子的循环时间延长了
2倍。
13.93 h,
纳米药物的最终目标是将活性药物以自由的分子形式传递到癌细胞内，并发挥其药效。 通常静脉注射到生物体的纳米药物要经历一个五级的级联步骤才能将药物递送到细胞内：
通
过血液的长循环、由 EPR效应在肿瘤部位富集、渗透到肿瘤组织深处、内吞进入细胞、细 胞内释放药物(Figure 1.6)。因此，尽可能地提高每一个步骤的效率才能实现最佳的药物传 递效率。
VC WIMln
Figure 1.5 Red blood cell (RBC) membrane-coated poly(D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA) nan oparticles (NPs). Cellular membra nes provide a robust n atural fun ctio nality to the particle. In comparative studies with polyethylene glycol (PEG)-coated NPs, RBC membrane-coated NPs exhibited a 39.6-h half-life compared with 15.8 h for PEG NPs.
传统纳米药物虽然降低了药物的系统毒副作用， 但是其对肿瘤的治疗效果还与理想状态
相差甚远，其原因非常复杂。 PEG化的纳米药物虽然减少了蛋白的吸附，但是由于位阻作 用降低了肿瘤细胞对纳米药物的内吞， 纳米药物进入细胞后由于聚合物降解缓慢， 药速率缓慢，药效不足。基于此，研究者们设计制备了具有多功能的 如主动靶向PLGA纳米抗癌药物和刺激响应
导致其释
PLGA纳米抗癌药物
PLGA纳米抗癌药物，这些纳米抗癌药物在临
PLGA纳米抗癌药物的发展，为其
床前试验中表现出了良好的抗肿瘤效果，极大地促进了 临床转化提供了无限的可能。
The CAPi^
of Cancer Drug De livery
* To be there 丿 To be free
〉 5 乳日戸(：卅円尺€33£3肓］＞ Q = QrX Q# X Qp X Q『X Q^
Figure 1.6 A sketch of the CAPIR cascade of a nano medici ne to deliver a free drug into cancer cells: circulation in the blood compartments, tumor accumulation and penetration, and subsequent cellular internalization and intracellular drug release.
2主动靶向PLGA纳米抗癌药物
通过对PLGA纳米粒子进行表面改性可以减弱
RES的清除作用，延长其循环时间，提
为了促
高纳米粒子在肿瘤组织的富集量。 然而大多数药物需要进入细胞内部才能产生作用，
进纳米药物快速、大量进入细胞内，研究者们在纳米药物的表面修饰具有主动靶向功能的配 体来促进细胞的内吞。在纳米药物的表面修饰肿瘤特异性的配体如抗体、抗体片段、多肽、 多糖、适配子、叶酸等，使纳米药物通过受体
高其在癌细胞内的富集，称为主动靶向(
-配体结合作用介导的内吞方式进入细胞，提 Figure 1.7B )。主动靶向型纳米药物通过增加与细
胞的有效结合、减少非特异性的吸附和摄取以及规避细胞的耐药等作用增加其在肿瘤细胞内 的富集。
Figure 1.7 (A) Passive targeti ng of nano carriers and (B) active targeti ng strategies. Liga nds grafted
at the surface of nano carriers bind to receptors overexpressed by can cer cells or an gioge nic en dothelial cells.
近些年来，研究者们设计了不同靶向配体修饰的 靶向递送，包括表面偶联抗体的
PLGA纳米药物用于多种肿瘤的主动
PLGA纳米药物、适配
PLGA
PLGA纳米药物、多肽分子修饰的
体修饰的 PLGA纳米药物［-66］、小分子修饰的 纳米药物。
2.1蛋白介导的的 PLGA纳米药物
PLGA纳米药物以及多糖饰的
近些年来，抗体、抗体片段、生长因子、 转铁蛋白等被用作靶向配体修饰在纳米药物的 表面以制备主动靶向纳米药物。抗体及其衍生物对其靶点具有非常高的特异性亲和力， 去的几十年中，单克隆抗体在癌症治疗中得到了广泛地应用。 如用于形成抗体-药物偶联物(ADCs)以及修饰在纳米粒子表面。
在过
例
很多抗体被用作靶向分子，
Benita报道了表面偶联西
妥昔单抗、包载了一种 PTX前药的PLGA纳米粒子，用于 EGFR过表达的非小细胞肺癌的 靶向治疗。CLSM结果显示，孵育 4h后，包载香豆素 6的纳米粒子在 A549细胞的细胞质 中显示出明显的荧光信号，相对于无靶向的纳米粒子，细胞对表面偶连了西妥昔单抗的纳米 粒子的摄取量更多。在加入单抗对细胞进行预处理之后，
纳米粒子荧光强度减弱，证明细胞
56天内，
对纳米粒子的摄取受到了抑制。荷瘤小鼠体内抑瘤实验结果显示，在接种之后的
相对于非靶向载药纳米粒子、自由药物，靶向载药纳米粒子具有显著提高的肿瘤抑制效果 (**p < 0.05)，并且显著延长了小鼠生存率
(***p < 0.001 ) °Du制备了 CA19-9抗体修饰的、
基于PEG-PLGA-PLL聚合物的、包载 PTX的纳米粒子(PTX-NPs-anti CA19-9)，联合超声 介导微泡摧毁(UMMD)技术用于胰腺癌的靶向治疗。
CCK-8实验结果显示，PTX-NPs-anti
CA19-9对人胰腺癌Capan-1细胞具有较强的杀伤能力， 孵育48h后，其IC 50为6.408 g/mL , 而无靶向 PTX-NPs为21.316 /g/mL。将细胞预先经过自由的抗体处理过之后，再加入 PTX-NPs-anti CA19-9 孵育，其 IC50 与无靶向组相当为 26.581 /g/m L 。此外， PTX-NPs-anti CA19-9 联合 UMMD 对细胞产生最强的杀伤作用，其 IC 50为 3.219 /g/mL。 PTX-NPs-anti CA19-9 和 PTX-NPs 都具有较长的循环时间分别为 36.10和29.20 h 较自由 PTX 显著延长。 在胰腺癌小鼠移植瘤模型体内抗肿瘤实验中， PTX-NPs-anti CA19-9 表现出较好的抑瘤效果， 其抑瘤率为 82.99%，高于PTX-NPs (62.24%)和自由PTX (16.02%)治疗组，并且显著延 长了小鼠的生存时间，其中位生存期为 63 天，而 PTX-NPs 和自由 PTX 治疗组分别为 51 和 43 天。另外， PTX-NPs-anti CA19-9 联合 UMMD 具更好的体内抗肿瘤效果，其抑瘤率 为 90.51%，小鼠中位生存期为 75天。
2.2 多肽的介导的 PLGA 纳米药物 与蛋白相比，多肽具有更多的优势，例如生产成本低、稳定性好、易于大规模生产、操 作简便以及较低的免疫原反应。而且，多肽与纳米粒子的偶联可以被精确地控制。近年来， RGD、GE11、cNGQ、iRGD、A6、T7、Angiopep-2 以及 Tlyp-1 肽等多肽被发现对多种肿 瘤细胞具有靶向性，被用作靶向配体修饰在纳米药物的表面。 例如，Jia ng设计制备了一种 T7
修饰的、包载卡莫司汀( BCNU )的 PEG-PLGA 胶束用于脑胶质瘤的靶向治疗。 MTT 结 果显示，在 U87 细胞中孵育 24 h 后， T7-PEG-PLGA/BCNU 的 IC50 值为 3.902 mg/mL ，相 对于 PEG-PLGA/BCNU 和自由 BCNU 分别低了 1.和 3.90 倍。体内分布实验结果显示， 包载 NIR 染料( BODIPY )的 T7-PEG-PLGA 胶束，在脑肿瘤部位的荧光强度明显高于
PEG-PLGA 胶束。在荷 U87 原位脑胶质瘤模型的小鼠体内研究 T7-PEG-PLGA/BCNU 、 PEG-PLGA/BCNU 以及 BCNU 的治疗效果， 通过生物发光成像实时监测肿瘤的大小。 Figure 1.8显示，在给药治疗 7天后，所有治疗组小鼠相对于第 0天时，脑部荧光强度减弱，说明 肿瘤缩小，肿瘤生长受到了抑制。在第 17天，经过三次给药治疗后， T7-PEG-PLGA/BCNU 治疗组小鼠脑部荧光强度进一步减弱，说明肿瘤得到了较好的抑制，而
PEG-PLGA/BCNU
和 BCNU 治疗组，小鼠脑部荧光强度增强，肿瘤在持续生长。上述实验结果证明，相对于 无靶向组 PEG-PLGA 胶束，靶向 T7-PEG-PLGA 胶束具有更好的肿瘤治疗效果。 Zhang 报 道了 Angiopep-2 多肽修饰的、包载 DTX 的 PLGA@Au 纳米粒子(ANG/GS/PLGA/DTX NPs), 用于脑胶质瘤的治疗。 细胞凋亡实验结果显示， 孵育 48 h 后，经过 ANG/GS/PLGA/DTX NPs 处理的 U87 细胞，其早期细胞凋亡比例为 29.2%，相对于无靶向组以及自由 DTX 组分别提 高了 2.2 和 1.9倍。将包载 IR780 荧光分子的纳米粒子注射到荷瘤小鼠体内后，通过活体成
像技术实时监测其在体内的分布情况。成像结果显示，在注射后的
ANG/GS/PLGA/DTX NPs在肿瘤组织维持较高的富集量，而且明显高于非靶向
2h到24h内,
GS/PLGA/DTX NPs。体内抗肿瘤实验结果显示， ANG/GS/PLGA/DTX NPs 较 GS/PLGA/DTX NPs具有显著增强的抑瘤作用，其肿瘤抑制率提高了
2倍。Chen制备了 iRGD修饰的基于
DSPE-PEG和末端修饰硫辛酸（LA ）的LA-PLGA-TPGS 两种聚合物的还原响应交联混合 胶束（iRGD-MM ）,将DTX靶向递送到a 5 B过表达的宫颈癌 Hela细胞内。流式细胞实 验结果显示，孵育 6h后，细胞对iRGD-MM 的摄取量相对于无靶向 iRGD-MM 能够更高效的通过受体介导的方式进入细胞中。
MM提高了 4倍，
MTT实验结果显示，在 Hela细
胞中iRGD-MM-DTX 的细胞毒性显著高于无靶向组 MM-DTX 以及自由DTX。在a 5 B低
表达的SMMC-7721细胞中iRGD-MM-DTX 和无靶向组 MM-DTX 的细胞毒性之间没有明显 差别，表明了在 Hela细胞中iRGD介导的肿瘤靶向作用促进了细胞对纳米药物的摄取。 2.3多糖的介导的 PLGA纳米药物
Conlral
BCNU ^EG-PLGA-BCMU T7 PEG PLG^BCNU
Figure 1.8 An ti-glioma efficacy of differe nt micelles on model mice. Real-time biolu min esce nee images of the glioma model n ude mice injected with sali ne, free BCNU, PEG-PLGA/BCNU, and T7- PEGPLGA/BCNU micelles on days 0, 7 and 17.
癌细胞的表面会过表达不同种类的糖， 其中在肝癌细胞表面有过量脱唾液酸糖蛋白受体 （ASGP-R ）的表达，ASGP-R成为肝癌靶向治疗的重要靶点。例如， Wang制备了普鲁兰 多糖衍生物（CAPL ）修饰的 PLGA纳米粒子、同时包载考不他汀（
（CAPL/PBAE/PLGA ）,用于肝癌的靶向治疗。普鲁兰多糖可以特异靶向到
CA4 ）和 PTX HepG2肝癌细
胞表面过表达的 ASGP-R。在荷HepG2肝癌的小鼠中 ，CAPL/PBAE/PLGA 具有良好的靶 向作用，能够显著提高 CA4和PTX的协同抗肿瘤效果。
此外，天然多糖 HA 在靶向药物传递领域引起了广泛的关注。 HA 是一种具有优异的生 物相容
性和生物可降解性的天然高分子。 CD44 和 RHAMM 是 HA 的结合受体， 其在多种具 有高度转移性恶性肿瘤细胞表面过表达，因而， HA 已经被广泛地应用于多种抗癌药的主动 靶向传递。例如，Zhong报道了基于 HA-b-PLGA的纳米粒子(SANPs),将DTX靶向递送 至CD44过表达的 MDA-MB-231 乳腺癌细胞(Figure 1.9A )。将香豆素-6 (C-6 )包载到纳 米粒子中，通过 CLSM实验研究 MDA-MB-231 细胞对靶向纳米粒子(C-6/SANPs)和无靶 向纳米粒子( C-6/PLGA )的摄取情况。 CLSM 实验结果显示， C-6/SANPs 组细胞的荧光强 度显著高于 C-6/PLGA 组( **p < 0.01 )。加入 HA 对细胞表面受体进行封闭之后， C-6/SANPs 组细胞内荧光强度显著降低 ( ***p < 0.001 )，证明细胞对 C-6/SANPs 的摄取量减 少。 MTT 实验结果显示 DTX/SANPs 对 MDA-MB-231 细胞具有较好的细胞杀伤能力， 其 IC 50为9.68ng/mL,显著低于 DTX/PLGA 的14.06 ng/mL(*p < 0.05)，说明HA介导的主动靶 向作用显著提高细胞对纳米粒子的内吞。小鼠活体荧光成像结果显示，在尾静脉注射包载 DiR 的纳米粒子后的 2 到 24 h 内, DiR/SANPs 在肿瘤组织的荧光信号强度显著高于 DiR/PLGA ,说明 HA 修饰的纳米粒子对 MDA-MB-231 肿瘤具有较好的主动靶向性( Figure 1.9B )。体内抗肿瘤实验结果显示， DTX/SANPs相对于DTX/PLGA 显著提高了肿瘤抑制效 果(**p < 0.01 )( Figure 1.9C)。最近，本课题组报道了包载 DTX的、表面修饰HA的PLGA 纳米粒子 (DTX-HPLGA ),用于原位 A549 肺癌小鼠的治疗。 MTT 实验结果显示, 孵育 48h 后载药纳米粒子(DTX-HPLGA )在CD44过表达的人肺癌 A549细胞中的IC 50为0.91g/mL。 体内生物分布实验结果显示 DTX-HPLGA 在肿瘤部位的富集量达到一个极高的水平,其值 为 13.7%,是自由 DTX 富集量的 4.4倍。此外,体内抗肿瘤实验结果显示, 相对于自由 DTX , DTX-HPLGA 具有显著提高的肿瘤抑制效果 (***p < 0.001 ),并且显著延长了小鼠的存活时 间,在 46天内所有小鼠均健康存活,而 DTX 组小鼠的中位生存期为 34 天。
Il
Orga nic soivenrt
BMi F_C^-b- J- • OvCKii xal.
fl 0 R
Figure 1.9 (A) The schematic illustration of the preparation and core shell structure of DTX-loaded PLGA-b-HA nan oparticles. (B) In vivo fluoresce nee images of DiR loaded DiR/PLGA and DiR/SANPs in MDA-MB-231 tumor-bearing female nude mice after tail vein injection of the formulations. (C) In vivo antitumor activity in MDA-MB-231-bearing female nude mice treated with various formulatio ns. Tumor growth curves evaluated by cha nges in tumor volume and the images of excised tumor.
2.4适配子介导的 PLGA纳米药物
适配子是由单链的 DNA或者RNA寡聚核酸折叠形成的特殊 3D结构，对靶向分子具有
成为了
高度的特异性和亲和性。适配子由于其分子量低、不会引发免疫原性并且容易制备，
靶向成像和治疗的优选靶向分子。 针对癌细胞表面不同的靶点， 研究者们制备了多种用于癌 症靶向治疗的适配子。 如AS1411可以靶向到癌细胞和肿瘤新生血管内皮细胞过表达的核仁 蛋白，Chen报道了包载 PTX的、AS1411修饰的PEG-PLGA纳米粒子(Ap-PTX-NP)，用 于脑胶质瘤的靶向治疗。 CLSM实验荧光定量结果显示，脑胶质瘤( C6)细胞对 Ap-NP的
摄取量相对于无 AS1411修饰的纳米粒子(NP)提高了 2倍，当加入过量的适配子对受体进 行封闭后，细胞摄取量与
NP相当(Figure 1.10A)，证明细胞对 Ap-NP的摄取主要通过受
Ap-PTX-NP在肿瘤组织的富集 0.25到25 h内，Ap-NP在肿
Ap-NP通
体介导的方式进行。荷瘤小鼠体内生物分布实验结果显示，
量随时间延长逐渐增大，在 0.5 h达到最大值，随后开始降低。
瘤组织的富集量均高于 PTX-NP以及Taxol ( Figure 1.10)。以上实验结果证明， 过AS1411与受体结合的介导作用显著提高了细胞对
Ap-NP的摄取，实现了高效的细胞内
PTX递送。Yu报道了包载沙利霉素( SAL)的、A15适配子修饰的 PLGA纳米粒子 (Ap-SAL-NP )，用于CD133过表达的骨肉瘤细胞的靶向治疗。流式细胞实验结果显示，
CD133过表达的Saos-2细胞对 Ap-NP的摄取量显著高于无靶向的 NP( p < 0.05 )。MTT实 验结果显示，孵育 48 h后Ap-SAL-NP和非靶向组SAL-NP对CD133过表达的Saos-2细胞 的增殖抑制作用具有显著性差异， Ap-SAL-NP的IC 50为2.18 g/mL ,相对于SAL-NP低了 4.92倍(**p < 0.01 )。体内治疗效果显示 Ap-SAL-NP治疗组小鼠肿瘤重量为 0.08 g,显著 低于SAL-NP组的0.31g以及对照组的 0.72 g,证明了 Ap-SAL-NP相对于无靶向 SAL-NP 具有显著提高的体内外抗肿瘤作用。
\"Tlfcirnw
■ Tax
口
Figure 1.10 (A) Quantitation of cellular association of the nanoparticles in C6 glioma cells. Values obta ined from 3000 cells per well (n=3) and expressed as mea n SD. **p < 0.01, ±gni fica ntly lower tha n the cellular associati on of coumari n-6-loaded Ap-NP. (B) PTX concen trati ons in the tumor at 0.25, 0.5, 1,2, 6, 12 and 24 h after admi nistratio n (n=4). Sig nifica nt differe nces found between the Ap-PTX-NP/PTX- N|J i和N lhe M3 ㈤叩乞 and marked as *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 respectively.
2.5小分子介导的 PLGA纳米药物
近些年来多种具有主动靶向作用的小分子如半乳糖
等被用做靶向配体， 用于制备主动靶向纳米抗癌药物。这些小分子制备简便、造价低、 小而且其修饰和表征方法相对简便。
Gal与肝癌细胞表面过表达的脱唾液酸糖蛋白受体
(ASGP-R)有很强的结合能力，因而被广泛应用于肝癌主动靶向纳米药物的制备 例如，例如， Duan 基于 mPEG-PLGA-PLL 和 mPEG-PLGA-PLL-Gal 两种聚合物，制备的
hip P (Gal)、叶酸(FA)、生物素(Biot in )
毒性
[, 90]。
Gal 修饰的 PEAL-Gal 纳米粒子可以靶向到肝癌。 CLSM 实验结果显示，三种不同的肝癌细 胞(HepG2、Huh7、PLC)对PEAL-Gal的摄取量明显高于无靶向
PEAL。荷瘤小鼠体内成
像结果显示，经尾静脉注射 Cy5 标记的 PEAL-Gal 和 PEAL 后，在 3到 48 h 内，在荷 HepG2、 Huh7、 PLC 三种皮下肝癌模型小鼠的肿瘤部位都有明显的荧光信号，而
PEAL-Gal 的荧光
信号明显强于 PEAL 。 PEAL 在肿瘤组织的荧光信号在 12h 达到最强，随后逐渐减弱。 PEAL-Gal 在肿瘤组织的信号一直保持较高的强度，在 48h 时仍然具有较高的强度，证明 PEAL-Gal 对肝癌具有优异的体外以及体内靶向性。
FA 是合成嘌呤和嘧啶的必要物质，其对叶酸受体具有高度的亲和力。叶酸受体在癌细 胞表面的表达量远高于正常细胞， 大概是正常组织表达量的
100-300倍。Sun报道了包载PTX
M109 )的协同
和顺铂(CDDP )的、FA修饰的PEG-PLGA纳米粒子，用于非小细胞肺癌(
治疗。通过细胞实验，筛选出 CDDP 和 PTX 的最佳协同治疗比例为 1:2。 CCK-8 实验结果 显示，在总药量是10(g/mL时，载药纳米粒子与细胞共同孵育
24 h后，靶向载药纳米粒子
Co-FA-NPs (CDDP:PTX=1:2) 组细胞存活率仅为 10%，而无靶向组 Co-NPs (CDDP:PTX=1:2) 约为 30%。相对于 Co-NPs (CDDP:PTX=1:2) ，靶向组 Co-FA-NPs (CDDP:PTX=1:2) 具有显著 提高的抗细胞增殖作用 (**p < 0.01 )。体内抗肿瘤实验结果显示， 在 FA 受体低表达的 A549 皮下肿瘤模型中， 经过Co-FA-NPs(CDDP:PTX=1:2)治疗后，肿瘤抑制率(TSR)为.96% , 对于 FA 高表达的 M109 肿瘤，其 TSR 为 95.03%。在 M109 皮下肿瘤模型中， 相对于 Co-NPs (CDDP:PTX=1:2) ，靶向 Co-FA-NPs (CDDP:PTX=1:2) 表现出显著提高的抗肿瘤效果( *p < 0.05)。
Biotin 是合成维生素 C 的必要物质， 是一种细胞生长促进剂， 生物素受体( biotinreceptor ) 在快速增殖的癌细胞表面有过表达。
Zha ng制备了包载表阿霉素(EPB)的、biot in修饰的
基于Chitosan-PLGA的纳米粒子(Bio-CS-PLGA/EPB )，用于乳腺癌 MCF-7细胞的靶向递送。 CLSM 荧光 图片显示 ， MCF-7 细 胞中 Bio-CS-PLGA/EPB 的 荧光信号 强度 明显高 于 CS-PLGA/EPB 。流式细胞实验结果显示， MCF-7 细胞对 Bio-CS-PLGA/EPB 的内吞量是 CS-PLGA/EPB 的 2 倍。包载 Cy5.5 的纳米粒子在荷 MCF-7 肿瘤的小鼠体内的荧光成像结果 显示， Bio-CS-PLGA 在肿瘤组织的富集量明显高于 CS-PLGA 。 3 生物信号刺激响应性性 PLGA 纳米抗癌药物
近些年来， 生物响应性聚合物纳米药物， 因其能够在靶点位置提高细胞的药物摄取量或 者触发药物快速释放而引起人们越来越多的关注。 肿瘤组织微环境以及肿瘤细胞内有很多特 点，例如，肿瘤组织呈弱酸性并存在较高的酶含量， 肿瘤细胞内内涵体以及溶酶体内
pH低、
细胞质和细胞核内 GSH含量高以及线粒体内活性氧（ ROS）含量高等。生物响应性的纳米 体系具
有一些独特的特征， 如不需要借助外部设备来实施刺激， 通过被动或主动靶向作用富
而且能够在肿瘤组
集在肿瘤组织后、能精确控制其在肿瘤组织或细胞器中的局部响应行为， 织或者肿瘤细胞内部实现自发响应等。
Tumor Cell
Figure 1.11 lllustration of biosignals existing in the tumor extracellular microenvironments and can cerous cells.
肿瘤组织细胞外微环境以及肿瘤细胞内部环境与正常组织的微环境不同如： 织具有弱酸性（pH 6.5-7.2）；（ 2）肿瘤组织具有高浓度的酶如基质金属蛋白酶（
（1）肿瘤组 MMP ）等；
（3）内涵体（pH 5.5-6.8 ）和溶酶体（pH 4.5-5.5）pH值低；（4）细胞质和细胞核内具有较 高浓度的GSH （2-10 mM） ；（ 5）溶酶体中存在大量的降解酶；
（6）线粒体内存在较高浓度
的ROS等（Figure 1.11 ）。近些年来，研究者们基于肿瘤微环境和细胞内环境设计了多种具 有生物响应性的 PLGA纳米药物，主要包括还原响应性 PLGA纳米抗癌药物以及酶响应性 3.1还原响应性性PLGA纳米药物
PLGA纳米抗癌药物。
PLGA纳米抗癌药物、pH响应性
细胞质和细胞核中较强的还原环境，一方面是由于 酶体中还存在溶酶体硫醇还原酶
GSH的存在引起的，另一方面在溶
（GILT ）和少量的Fe2+ 。GSH是体内含量最丰富的低分子
量生物还原剂，通过 NADPH和GSH还原酶维持其还原性。相对于正常细胞，肿瘤细胞质 和细胞核内GSH浓度更高，大约为2-10 mM，比血液中GSH的浓度高10-1000倍。研究者 们利用细胞内外高 GSH浓度差，设计制备了具有还原响应性的纳米抗癌药物，实现药物在 细胞内的快速响应释放。还原响应性纳米载体通常都含有双硫键，双硫键在细胞外能够稳 定的存在，而在细胞内高浓度 GSH作用下快速发生断裂，将疏水的双硫键转变为亲水性的 巯基，破坏纳米载体的结构，进而实现药物在细胞内的 GSH 触发性释放。
文献报道的基于 PLGA 的还原敏感纳米载体的设计有两种途径，一种是通过含有双硫 键的基于
PLGA 的两亲性聚合物自组装得到；另一种是以 PLGA 作为内核，通过引入含有 双硫键的乳化剂制备得到的。 例如， Luan 制备了一种含有双硫键的偶联 DTX 的聚合物前药 mPEG-PLGA-SS-DTX ，这种两亲性的聚合物前药经过自组装形成含有双硫键的胶束 (PP-SS-DTX )，同时包载自由 DTX ( Figure 1.12A )。在正常生理条件下， PP-SS-DTX/DTX 对 DTX 的释放量在 12 h 后达到一个饱和平衡， 96 h 后其累计释放量仍不到 40% 。而在模 拟细胞内还原环境条件下 (10 mM DTT )，DTX 的释放量随时间延长逐渐增多， 在 48 h 累 计释放量为 60%。 MTT 结果显示，在 MCF-7 细胞中，孵育 24 h 后， PP-SS-DTX/DTX 的 IC 50为0.83 g/mL,比自由DTX低了 10.77倍，这与PP-SS-DTX/DTX 能够快速将 DTX 释 放到细胞质中高效地抑制细胞的增殖有关， 其与 DTT 和 GSH 的作用过程如 Figure 1.12B 所 示。Chen报道了基于甘草次酸(GA)修饰的嵌段聚合物(GA-PEG-SS-PLGA )自组装形成 还原敏感胶束,包载丹参酮 IIA (TAN IIA) ,用于肝细胞癌的靶向治疗。 GA-PEG-SS-PLGA 胶束在含有 10 mM DTT 的介质中,经过 12 h 纳米粒子溶胀,粒径逐渐增大, 24 h 后纳米 粒子发生团聚。在不含 DTT的介质中，其粒径在 24 h后未发生任何变化。对于不含双硫键 的GA-PEG-PLGA 胶束，即使在含有 10 mM DTT的介质中经过了 24 h,其粒径也没有发 生变化。体外释放实验结果显示,在含有
10 mM DTT 的介质中,经过 24 h 后,
GA-PEG-SS-PLGA 对 TAN IIA 的累计释放量为 60%,是在不含 DTT 的介质中释放量的 3 倍。而非还原敏感对照组 PEG-PLGA 胶束,其对药物的释放行为并没有受到 DTT 的影响, 24 h 内的累积药物释放量不足 20%。以上结果证明,含有双硫键的 GA-PEG-SS-PLGA 胶束 在正常生理条件下保持较高的稳定性而在还原环境中能够更快更多地将药物释放出来。
此外,
Sun报道了基于 HA-聚乙烯亚胺(PEI SS )-PLGA 嵌段共聚物的纳米粒子(HPRPSP),用于 DTX 和 siRNA 的细胞内协同递送， 由于中间段含有双硫键， 使得 HPRPSP 具有还原敏感 性。体内成像结果显示，
Dir标记的HPRPSP在肿瘤组织的富集量在
2、4、8 h时均高于非
还原组 ( HPP)，8 h 后的离体器官荧光成像结果显示， HPRPSP 在肿瘤组织的荧光强度也明 显高于HPP，荧光定量结果显示 HPRPSP在肿瘤组织的富集量是 敏感纳米粒子相对于非还原敏感对照组能够更快地将药物释放出来。
HPP的1.5倍，证明还原
Tffa'lFVI'R
Figure 1.12 Micelle formatio n (A) and disulfide cleavage process by DTT or GSH (B). R1 and R2 represe nt for mPEG-PLGA and DTX, respectively.
通过引入含有双硫键的乳化剂也可以制备还原敏感
PLGA纳米载体。例如，Hua ng基于
含有双硫键的 mPEG-S-S-C 16、Lecitin和PLGA三种聚合物制备了具有还原响应性的纳
米粒子(LPNPs) (Figure 1.13)，用于DOX和雷公藤内酯(TPL)的协同细胞内递送。 将PLGA 和DOX以及TPL同时溶解在 DMF中，室温搅拌 2 h后，将其滴加到 mPEG-S-S-C 16和 Lecitin的乙醇溶液中，透析后得到具有还原敏感性的、以
PLGA为核、包载 DOX/TPL的
纳米药物(DOX/TPL-LPNPs )。体外释放实验显示， 在含有10 mM DTT 的介质中，经过48 h接近78%的DOX从DOX/TPL-LPNPs中释放出来。在同样条件下，
TPL的释放行为与
DOX 一致。Botella将含双硫键的双三乙氧基硅烷( TESPDS)包被到 PLGA的表面，制备 了具有还原敏感性的纳米粒子
(POSN-2)，经还原剂 DTT刺激后可以快速释放包载在纳米
粒子内部的分子，制备过程如 Figure1.14A所示。体外释放实验显示，在未加还原剂 DTT处 理之前，POSN-2的释放行为与无还原响应性的
PSN 一致。在2 h时，经DTT处理之后，
Figure 1.14B )。未经过表面 POSN-2和PSN。
POSN-2表现出较快的释放行为，说明具有较好的还原响应性( 修饰的PLGA@CTAB,由于稳定性较差，其释放明显快于
Figure 1.13 The schematic drawing (LPNPs). DOX:
of dual drug-loaded lipid -polymer hybrid nano particles mPEG-S-S-C 16
mono methoxy-poly(ethyle ne
doxorubici n;
glycol)-S-S-hexadecyl; PLGA: poly(d,l-lactide-co-glycolide); TPL:triptolide.
TISPK
A
redox-resp on sive disulfide molecular gates. (B) Cumulative release profiles of pyre ne-c on tai ning materials in PBS at 37 C. In thecase of POSN-2 material, DTT (100 mM) was added at t = 2 h.
- fqJS &
壬•世最近我们课题组报道了一种包载 DTX的、新型还原敏感 PLGA纳米粒子(rHPNPs),
E-SS-寡聚(Y
DTX
其能够完全抑制小鼠原位 A549肺癌的生长。利用具有还原敏感性的维他命 二乙二醇单甲醚-L谷氨酸酯)(VE-SS-OEG)作为乳化剂，通过纳米沉淀法制备了包载
Figure 1.14 (A) Syn thesis layout of pyre ne-loaded PLGA-orga no silica nano particles with 的PLGA纳米粒子(DTX-rPNPs)，随后通过 HA上的-COOH和VE-SS-OEG末端-NH 2的 酯化作用将HA包被在DTX-rPNPs的表面，制备得到还原敏感、
HA可摒弃的PLGA纳米
药物(DTX-rHPNPs)( Figure 1.15)。rHPNPs 在 PBS 介质中 1000 倍稀释和在含 10% FBS 介质中，粒径均未发生明显变化，
说明其具有良好的胶体稳定性。
在含有10 mM GSH的还
原介质中，经过12 h rHPNPs发生溶胀，而在不含 GSH的介质中12 h内粒径保持不变，证 明rHPNPs具有良好的还原响应性。体外释放实验显示，经过
48 h在含有10 mM GSH的
TISPK
介质中rHPNPs对DTX的释放量为 80%，而在正常生理条件下释放量不足 1.16A)。体内抑瘤实验结果显示，在原位移植 给药治疗的16天内能够完全抑制肿瘤的生长
30% (Figure
A549人肺癌的小鼠模型中， DTX-rHPNPs在 (Figure 1.16B)，并且显著延长了小鼠的生存时
32天，相对于PBS对照组
间(50天完全存活)。而自由DTX治疗组小鼠的中位生存期为
(20天)有所延长(Figure 1.16D)，但是由于其具有较强的系统毒副作用，弓I起了小鼠体重 下降(Figure 1.16C)。
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Figure 1.15 lllustrati on of the preparati on for DTX-loaded reduct ion-sen sitive HA-coated PLGA nan oparticles (DTX-rHPNPs).
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Figure 1.16 (A) GSH-triggered drug release of DTX-rHPNPs (nanoparticle concentration: 0.2 mg/mL) at pH 7.4 and 37 C in PB buffer (10 mM) (n = 3). (B) Luminescence optical imaging of cancerous lung. (C) Body weight changes (n = 6) and (D) survival rates (n = 5) of orthotopic huma n A549-Luc lung tumor-beari ng nude mice. 3.2 pH响应性PLGA纳米药物
肿瘤细胞增殖迅速主要依赖糖酵解的方式产生能量,
活跃的糖酵解产生出大量的酸性副
产物，产生的酸性产物无法及时被清除，导致了肿瘤组织具有弱酸性， 肿瘤细胞的内涵体以及溶酶体的
pH大约为6.5-7.2。
pH值更低，在4.5-6.8之间。研究者们巧妙地利用不同组
织及细胞内外pH的差异，设计制备 pH响应性纳米药物，可以提高肿瘤细胞对纳米药物的 摄取或加快药物在肿瘤部位或者肿瘤细胞内的释放。 缩酮键、腙键以及酰胺键，其在不同
具有酸敏感性质的化学键主要有缩醛键、
pH条件下会发生断裂。除可断裂的酸敏感化学键，还
改变电负性，表现出一定
有一些特殊的官能团如氨基、 咪唑环等在酸性条件下可以质子化，
的酸敏感性质。另外，将一些在酸性条件下可以产生气体的物质与抗癌药物同时包裹在纳米 载体的内部也可以实现药物的酸响应释放。
Blood pH Tumor pHe
Figure 1.17 The schematic represe ntati on depict ing the cen tral con cept of pH-se nsitive micelles based on PLGA-PEG-H 7 K 9 (R 2 ) 2 copolymer. Oligohistidine (H 7 ) has the pH dependent
amphoteric properties (hydrophilic-hydrophobic) by protonation-deprotonation of the imidazole ring. During circulation in normal tissue microvasculature (pH 7.4), the cell-penetrating oligoarg inine (R 2 ) 2 is an chored on the micelle core and shielded by PEG shell of the micelle due to the deionization of H 7 (pH > pKb); but in tumor microenvironment (pH 6.8), R 4 is exposed to the outside of PEG shell thanks to the ionization of H 7 (pH < pKb), followed by in teracti on with tumor cells and en docytosis.
据文献报道基于 PLGA的pH响应型纳米抗癌药物一般有两种， 化的聚合物，如组氨酸(histidine )其结构中咪唑环的
一种是通过引入可质子
pKa约为6.0，或其衍生物来制备。
PLGA纳米粒
另外一种是将一些在微酸条件下可以产生气体的物质与抗癌药物一起包裹在
子的内部制备得到。例如， Chiu 将可质子化的氮 -乙酰组氨酸修饰到 TPGS 上合成了 pH 敏 感的表面活性剂( NAcHis-TPGS )，由其制备得到的 PLGA 纳米粒子( NHTPNs )具有 pH 敏感性。 NHTPNs 到达肿瘤组织之后，在肿瘤组织弱酸环境下，氮
-乙酰组氨酸中咪唑环质
子化，使纳米粒子表面带上正电荷， 促进了细胞对纳米粒子的摄取。 流式细胞实验结果显示， 当细胞培养介质从 pH 7.4 降低为 pH 6.3时，细胞对 NHTPNs 的摄取量提高了 1.5 倍，表明 在弱酸条件下 NHTPNs 表面电荷的转变可以提高细胞的内吞。 Zhang 将一种 pH 响应性的 多肽( H 7 K(R 2 ) 2 )修饰到 PEG-PLGA 胶束的 PEG 末端，在肿瘤组织微酸环境中，带正 电荷的(R 2 ) 2被暴露在胶束表面， 可以促进细胞对胶束的摄取
(Figure 1.17)。H 7 K(R 2 ) 2
多肽由 pH 响应的寡聚组氨酸 H 7和细胞穿透肽寡聚精氨酸 (R 2 ) 2 组成。 在 pH 7.4的生理 环境下， H 7 是去离子化形式，表现出疏水性质，使得 (R 2 ) 2 被“固定”在胶束的核周围，从 而被 PEG 屏蔽。而当胶束通过循环来到肿瘤组织的微酸环境后，
H 7 通过咪唑环的质子化
作用，转化为亲水性基团，将穿膜肽 (R 2 ) 2 暴露到胶束外表面，从而促进了细胞对胶束的 摄取。流式细胞实验结果显示，在 pH 6.8 时， MCF-7 细胞对 PM-H 7 K(R 2 ) 2 的摄取量是 pH 7.4 时的 1.6 倍。 Wang 制备了一种对肿瘤组织微酸环境和内涵体以及溶酶体弱酸环境具 有逐级响应行为的 PLGA 纳米粒子( CAPL/PBAE/PLGA )用于微管抑制剂考不他汀 (CA4 ) 的高效肿瘤内递送( Figure 1.18)。 CAPL/PBAE/PLGA 以带负电荷的普鲁兰多糖衍生物
(CAPL )为壳，以带正电荷的聚 -(3■氨基酯)(PBAE )和PLGA为内核制备得到。CAPL 结构中含有多个
3羧酸酰胺基团，其在肿瘤组织微酸环境中( pH 6.5)发生断裂，末端电
荷由负变正。 带负电荷的 CAPL 从 CAPL/PBAE/PLGA 表面脱落，将带正电荷的 PBAE/PLGA 暴露出来，从而促进肿瘤细胞对纳米粒子的摄取。含有哌啶环的 体(pH 5.5)中表现出较强的质子海绵效应，
PBAE，在内涵体以及溶酶
能够快速逃离内涵体，将药物释放到细胞质中。
体外释放实验结果显示， CAPL/PBAE/PLGA 对 CA4 的释放具有 pH 刺激响应性。当释放介 质的pH从7.4降到6.5以及5.5时，CAPL/PBAE/PLGA 对CA4的释放量逐渐增加。在pH 5.5 时， CA4 的释放急剧加快，在 24 h 内的累计释放量达到了 70%。流式细胞实验结果显示， HepG2 肝癌细胞对的 CAPL/PBAE/PLGA 的摄取量， 随着 pH 的降低( pH 7.4-6.5)显著增加 , 由于在弱酸条件下， CAPL 从纳米粒子表面脱落，将带正电荷的 PBAE/PLGA 暴露出来， PBAE/PLGA 通过与细胞膜表面的负电荷作用快速进入细胞。
CAPL FB4E.PLGA
^fipr
Turner mlcTOvrivkonmni
PBAEPLGA
Cloved CAPL
Figure 1.18 The illustration of stepwise pH-responsive mechanisms of CAPL/PBAE/PLGA nan oparticles in the tumor microe nvironment and in in tracellular en dosome and lysosome.
此外，通过包载一些在肿瘤细胞内涵体、溶酶体酸性环境中可以产生气体的物质，如
NH4HCO3来制备pH响应性PLGA纳米药物。例如，Ma制备了同时包载 NH4HCO3和抗原 的PLGA纳米粒子，在内涵体以及溶酶体酸性环境中，
NH4HCO3与H+作用，产生CO2和
NH3两种气体，两种气体能够破坏纳米粒子结构，快速释放出包载在纳米粒子内部的抗原。
该纳米粒子可以在内涵体和溶酶体中释放抗原， 其过程如Figure 1.19A所示。体外释放实验
10%，而
显示，pH敏感的PLGA纳米粒子在pH 7.4时24小时内，抗原的累积释放量不到 在模拟内涵体和溶酶体酸性条件下
(pH 6.5和pH 5.0)累积释放量超过了 85% (Figure 1.19B)。
10%
然而，对于未包载 NH4HCO3的PLGA纳米粒子在pH 5.0时，抗原累积释放量不足 (Figure 1.19C)。
NH.
PLGA shell
CO3
Innw oona
Antigens
CO2
NHtHCOx
B I
pH-responsive PLGA NPs and their working mechanism. In vitro release of antigens from (B) pH-responsive PLGA NPs and (C) normal PLGA NPs incubated in test media with different pH values to
Figure 1.19 (A) Schematic illustrati ng the compositi on /structure of the as-c on structed
mimic the cytoplasm (pH 7.4), early endosomes (pH 6.5), and late endosomes/lysosomes (pH 5.0) at 37 o C.
3.3 酶酶响应性性 PLGA 纳米药物
在肿瘤组织中存在一些特殊的酶， 例如蛋白酶、 糖苷酶以及磷脂酶， 其在肿瘤组织的浓 度较高， 可以提高细胞对纳米药物的摄取、 增强纳米药物的肿瘤组织穿透能力以及加快药物 的释放。Tang设计制备了、酶和 pH双重响应的PLGA纳米粒子，将 DOX递送至耐药乳腺 癌 MCF-7/ADR 细胞中。 该纳米粒子由 PEG-PLGA-P(L-glutamic acid) (PGlu) 自组装形成， 当 pH > 6.0 时， PGlu 为卷曲螺旋构象，呈溶解状态，并且带负电荷，通过静电作用包载
后形成载药混合纳米粒子。而当进入细胞内涵体和溶酶体后，介质酸性变强，
DOX
PGlu 嵌段发
生构型转变，变为刚性的a螺旋构象，由亲水变疏水将DOX释放出来。蛋白酶K可以快速 将 PLGA 中的酯键以及 PGlu 中的酰胺键降解掉， 将聚合物逐步降解， 最终降解为单体分子。 体外降解实验证明，在含有 6 IU/mL的蛋白酶K的介质中，PEG-PLGA-PGIu，在37C条件 下，经过 10 min 就被全部降解为寡聚片段，经过 24 h 后完全降解为相应的单体。体外释放 实验显示，在含有蛋白酶 K的介质中，当为pH分别为7.4和5.0时，DOX在6 h的累积释 放量分别达到了 60%和 80%，证明蛋白酶 K 的存在时，聚合物发生降解加快了 DOX 的释 放。
4 纳米高分子抗癌药物存在的问题及解决策略 纳米药物的临床转化过程和必要条件纳米药物的成功临
床转化是一个充满挑战的过程
(Figure1.20),需要经历大量的临床前研究，之后要经过临床I、n、川、W期试验阶段的 研究，证明其具有足够的体内用药安全性(I期)和有效性(H期)
，以及能够在大量的患
，最终才
者身上具有良好的治疗效果(川期)，并且能够通过长期的用药安全性评估(W期) 能被 FDA 批准应用于临床。
Income nsnapsftfcfes
5 空心皿 Chernosynthe5ts & Cha racten ration
Pofymer or namp亦ca
lanomedicine
Jrn.tr® studies
0
Climcal trials In human
Phase I. Safety Phae« II. Efficacy
FDA'flprr K i!
Pfiuse III, With large populalicxi P^asu IV, LongteriTi b 纳米药物需要具备以下条件才能推进其临床转化： （1）制备纳米药物的载体材料需要具 有较高的安全性，材料安全性是临床试验首要考量因素；（2）纳米药物要具备足够的有效性， 具有高效肿瘤抑制作用的纳米药物需要具有较长的体内循环时间、 肿瘤细胞内的有效药物浓度是成功治疗肿瘤的关键； 较高的细胞摄取量，提高 （3）纳米药物要满足大批量生产的需求， 因此，对 其制备过程应该简单可重复、而且可以规模化地生产以及具有较低的生产成本等。 研究者们来说，充分了解纳米药物的临床转化过程并在早期的研究阶段制备出具有较好的生 物相容性、较高的药物有效性、及易于进行规模化生产的纳米药物极其重要。 4.1载体材料的安全性 目前文献报道的很多纳米药物使用一些不可降解的材料，如聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA ）、聚丙烯酰胺（PAA）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯酸酯等。由于这些材料很难被降 解和排除体外，由其制备的纳米粒子很可能在体内聚集累积， 症反应等。另外其安全性和生物相容性研究数据不足， 在体内产生一些慢性毒性和炎 因 这些都降低了其临床转化的可能。 此，在设计制备纳米药物时，应首先考虑选用具有良好生物相容性以及生物可降解性的高分 子材料，如 PEG、PLA （聚丙交酯）、PLGA、聚己内酯（PCL）等。PLGA已经被US FDA 批准用于人体药物递送系统，可以作为纳米药物的优选载体材料。 4.2纳米药物的体内稳定性 纳米药物表面PEG化可以有效避免纳米药物被 RES清除，在一定程度上延长了其循环 时间，但是其稳定性仍然需要加强。 纳米药物经静脉注射到体内后，会被高倍稀释，当其浓 度低于临界聚集浓度（CAC ）时将会发生解离，导致药物早释。泄漏出来的药物会导致正 常组织药物浓度过高，从而引发强烈的毒副作用，并且有可能由于药物析出导致局部血管栓 塞，引发一系列的并发症， 也会降低纳米药物在肿瘤组织的富集， 从而降低药物的抗肿瘤效 果。这些问题都是由于纳米 药物在体内的稳定性不足引起的。 针对这一问题， 研究者们提出 了可采用化学交联或者物理交联的方法来提高纳米药物的体内稳定性。 物理交联的方法主要包括正负电荷间静电作用、 氢键作用以及特定官能团之间的堆积作 用(如 -作用)等。例如 Hennink 报道了通过聚合物链之间以及聚合物与药提高肿瘤治疗效 果 。 利 用 PTX 和 聚 合 物 聚 乙 二 醇 -b- ( 氮 - ( 2- 卞 氧 基 丙 基 ) 甲 基 丙 烯 酰 胺 ) (PEG-b-P(HPMAm-Bz) )疏水段末端的苯环之间以及聚合物链段苯环之间的 PTX的包载能力，形成稳定的核交联胶束。交联后胶束的体内循环时间( -作用可以提高 ti/2, B)为8 h, 相对于无交联作用的胶束( Genexol-PM，0.21h)显著延长，AUC为1800⑷h/mL，显著高 于自由的PTX (AUC : 80 © h/mL )。较长的循环时间极大地增强了药物在肿瘤组织的富集， 注射 24 h 后，肿瘤组织富集量为 8 ID%/g ，而自由 PTX 仅为 0.4 ID%/g 。 化学交联包括可逆的化学交联和不可逆的化学交联。 不可逆的化学交联通过在聚合物末 端或者侧链上修饰可进行聚合的丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、苯丙烯基、咪唑等，在可见光 / 紫外光照射下发生聚合反应实现交联， 或者通过将叠氮基和炔基分别修饰在聚合物链上通过 点击化学反应实现化学交联。我们课题组报道了 Gal 修饰的核交联生物可降解聚合物胶束， 将 PTX 靶向递送到 HepG2 肝癌细胞。交联胶束由 Gal 修饰的聚乙二醇 -聚己内酯 (Gal-PEG-PCL) 和聚乙二醇 -聚丙烯酸酯碳酸酯 -聚己内酯 (PEG-PAC-PCL) 两种聚合物在水溶 液中自组装后，经紫外光照射，丙烯酸酯发生交联形成核交联的胶束。体外释放实验显示， 在pH 7.4的PB中在37C下，将载药胶束稀释 10倍后(0.0075 mg/mL ),经过94 h，交联 70%，结果证实交联作用提 MTT 结果显示在 PTX 为 6 Gal-PTX-NCLM 胶束对 PTX 的累积释放量仅为 25%，非交联胶束的释放量为 高了胶束的稳定性，减少了药物的泄露。然而，值得注意的是， ⑷/mL、孵72h后，核交联胶束Gal-PTX-CLM 的细胞毒性甚至没有非交联组 的高(18% vs15%),很明显这是由于 PTX很难从Gal-PTX-CLM 中释放出来。 不可逆化学交联虽然可以提高纳米药物的稳定性， 减少药物的早释， 延长循环时间， 提 高在肿瘤组织的富集量， 但是也可能会阻碍纳米药物在靶点的药物释放， 降低药物的肿瘤抑 制效果。 近些年来， 研究者们发现具有生物刺激响应性的可逆交联纳米药物可以同时具备较 高的循环稳定性和在肿瘤细胞内快速释放药物的特性。 Chen 设计了还原敏感的双硫戊环交 联聚氨酯胶束( CCL-PUMs )用于肝癌的治疗。 CCL-PUMs 由聚乙二醇 -双硫戊环聚氨酯 - 聚乙二醇(mPEG-PU(SS)-mPEG )在水溶液中自组装后， 加入催化量的 DTT形成交联稳定 的胶束。未交联的 PUMs , pH 7.4的PBS中37C下，经过 48 h的药物释放量为 41%。 CCL-PUMs在pH7.4的PBS中37C下，48 h的累积药物释放量为 23%，而在加入10 mM 的 GSH 后，接近 90%的药物被释放出来。 交联作用增强了 CCL-PUMs 的稳定性， 减少药物 的泄露； 而在模拟细胞内还原环境条件下， 药物快速释放， 相对于未交联的胶束其体内抗肿 瘤效果显著增强 (**p < 0.01 )。本课题组制备了多种基于双硫戊环交联的还原敏感纳米载体。 利用天然抗氧化剂硫辛酸( LA )对聚合物进行后修饰，制备具有还原响应性的可逆交联纳 米体系，用于多种癌症的高效治疗。将 LA 以及赖氨酸修饰在 HA 的侧链，制备具有不同 LA 取代度的接枝聚合物( HA-Lys-LA x ， (x=5 、 1 0、 2 8 ))， HA-Lys-LA x 在水溶液中自组 装、交联后可以高效的包载 DOX ，减少 DOX 在正常生理条件下的泄露，在模拟细胞内还 原环境时又可以快速将 DOX释放出来。HA-Lys-LA 5 、HA-Lys-LA 10 和HA-Lys-LA 28 随 LA含量的增多交联度逐渐增大，形成的纳米粒的 应地纳米粒子的粒径逐渐减小分别为 CAC分别为8.8、7.5和6.2 mg/L，相 219、175和152 nm。体外释放结果显示，交联之后 纳米粒在 pH 7.4、 37 o C 对 DOX 的释放量显著降低，以 HA-Lys-LA 10 为例，未交联纳 米粒在22 h内的累积释放量约为 80.3%，相应的交联纳米粒仅为 24.2%；在含有10 mM GSH 的介质中交联的 HA-Lys-LA 5 、HA-Lys-LA 10 和HA-Lys-LA 28 对DOX的释放显著加快， 累积释放量分别为 .4%、 86.5%和 79.7%。具有较高交联度的交联的 HA-Lys-LA 28 形成的 交联纳米粒X-NP-DOX具有较长的体内循环时间(4.83 h)。将X-NP-DOX通过尾静脉注射 到荷 MCF-7/ADR 肿瘤的小鼠体内， 10 h 后在肿瘤组织的富集量为 12.71%ID/g ，相对于自 由的 DOX 提高了 20 倍( 0.63%ID/g )。类似的， LA 修饰的聚多肽接枝 HA 聚合物 (HA-PBLG-LA )，自组装形成核交联纳米粒子包载 DOX( DOX-CLNPs )对乳腺癌表现出 了良好的治疗效果，其制备过程如 Figure 1.21A 所示。 CLNPs 具有较高的稳定性，在 1000 倍稀释条件下以及 10% FBS中保持粒径不变(Figure 1.21B )。DOX-CLNPs在pH7.4、37 C 下，经过30 h,对DOX的释放量仅为17.7%，在模拟细胞内还原环境(10 mM GSH)时， DOX释放量显著提高，约为 91.5% ( Figure 1.21C )。体内实验表明，该纳米粒子具有超高 的小鼠体内最大耐受剂量( > 100 mg/kg ),是脂质体阿霉素的 5 倍,显著降低了药物的毒副 作用,这与交联结构有很大相关性。 ■ PBLG 小 —CLNP -^NCLXP —CLKP, KO-fold djlutim —NCLNP, lOd-1»)d clilntinn —CLNPP LO^PTBS 2-»h ♦ btcxcsponsivity *ngh druj'oadn^ by Tp*n ttscfcng IDO tOOO Size UUll) lOlKMi sell aMembl/ i aulocroEEiinkirg 、o-HslaTiH HAeE --- 二二:lune (11 DO^-CLSJPS Figure 1.21 (A) lllustration preparation of robust, active tumor-targeting and fast bioresponsive an tica ncer nano therapeutics based on hyalur onic acid-g-poly(c-be nzyl-L-glutamate)-lipoic acid (HA-PBLG-LA) conjugates. (B) Size distribution and colloidal stability of HA-PBLG-LA CLNPs and NCLNPs measured by DLS. (C) In vitro release of DOX in the prese nee or abse nee of 10 mM GSH from DOX-CLNPs. The drug release studies were performed at a concentration of 0.2 mg/mL. Data are prese nted as mea n SD (n =±. 另外，我们实验室设计合成了一系列基于双硫戊环碳酸酯( DTC )的聚合物，通过含 例如， DTC的聚合物制备的可逆交联的聚合物纳米药物具有较好的稳定性以及还原响应性。 cRGD多肽修饰的PEG-P(CL-DTC)聚合物，自组装形成胶束同时包载 DOX，内核发生自交 联形成可逆核交联胶束(DOX-cRGD-RCCM)，其具有较小的尺寸(50 nm)。体外释放实验 显示，DOX-cRGD-RCCM 在生理环境下稳定性好、药物泄露少，经过 不足10%，而在含有10 mM GSH 的介质中，累计释放量为 较长的循环时间约为 4.7 h，相对于未交联胶束提高了 4.3纳米药物的肿瘤组织穿透性 24 h后DOX释放量 85%。 DOX-cRGD-RCCM 具有 3倍。 聚合物纳米药物通过 EPR效应富集在肿瘤组织， 然而，肿瘤组织血流的中断或者肿瘤 血管坍塌了纳米药物从血液到肿瘤组织的运输。 内血管之间的远距离以及致密的肿瘤内基质所牵制。 纳米药物向肿瘤组织深处的渗透被肿瘤 通常在肿瘤组织中， 血管被一层致密的 因此，具有较强的 基质包被，纳米药物需要穿透数百微米厚的基质才能到达肿瘤细胞表面。 肿瘤组织穿透能力的纳米药物才能实现较好的治疗效果。 据文献报道，可通过调节纳米药物 的尺寸和引入细胞穿透肽的方法来增强纳米药物在肿瘤组织的渗透。 纳米药物的尺寸是纳米药物在肿瘤组织富集以及渗透的重要决定性因素之一。 文献报道 相对于大尺寸的纳米药物，尺寸在30 nm左右的纳米药物对胰腺癌具有增强的组织穿透能力 以及较好的抗肿瘤活性。另外，研究者们发现肿瘤穿透肽，例如 Lyp-1 (CGNKRTRGC)能够增强药物或者纳米粒子的肿瘤穿透能力。将 iRGD (CRGDKGPDC)和 iRGD和小分子药物 如DOX、纳米药物Abraxane、Doxil、曲妥珠单抗混合后，静脉注射到体内，可以增强药物 的穿透能力，提高治疗效果。此外，还可以采用双多肽策略制备同时具备主动靶向功能和肿 瘤组织穿透功能的纳米药物， 提高纳米药的抗肿瘤效果。 Shi报道了 cRGD和TAT双多肽修 DOX@MSNs-cRGD/TAT)，经尾静脉注射 饰的、包载DOX的超小介孔二氧化硅纳米粒子( 到荷Hela皮下瘤的小鼠体内后，几乎可以完全抑制肿瘤的生长。肿瘤组织免疫荧光图片显 示，DOX@MSNs-cRGD/TAT在血管具有较多的富集，并且可以从血管溢出、渗透到肿瘤较 深的位置，说明其具有较强的肿瘤穿透能力。这是 cRGD对肿瘤血管和细胞膜的主动靶向 作用以及 TAT多肽较强的细胞膜穿透能力共同作用的结果。最近我们课题组制备了 cRGD/TAT双多肽修饰的聚乙二醇-聚二硫戊环碳酸酯-己内酯(PEG-P( DTC-co-CL )),由 其制备了可逆交联胶束(cRGD/TAT CMs)具有高效的肿瘤穿透能力。流式细胞实验显示， 脑胶质瘤U87细胞对cRGD/TAT CMs的摄取量分别是仅有 cRGD多肽修饰的胶束(cRGD CMs)以及无多肽修饰的胶束(PEG CMs )的8.3倍以及18.3倍。cRGD/TATCMs具有显著 增强的肿瘤穿透作用， 不仅在血管丰富的肿瘤组织边缘有较高的富集量， 而且在肿瘤组织较 深的位置也有大量的富集 (Figure1.22)。体内抑瘤实验结果显示， 相对于cRGD单一多肽修 饰组cRGD CMs和无多肽修饰组 PEG CMs，cRGD/TAT CMs显著提高了对肿瘤生长的抑制 作用(*p < 0.05, **p < 0.01 )。 A Figure 1.22 Tumor pen etration behavior of Cy5-labeled cRGD20/TAT10 CMs studied by confocal microscopy. Penetration of Cy5-labeled micelles (A) at the edge and (B) at the interior of the tumor tissue. Tumor sections were obtained from U87MG tumor-bearing mice 12 h after tail vein injection of Cy5-labeled micelles. The nuclei are stained with DAPI (blue), blood vessels are stained with CD31 (green), and Cy5-labeled micelles are presented in red. The scale bar is 50 m.
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