高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中氯霉素不确定度评定

分析检测Analysis and Testingdoi:10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2019.16.045高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性 食品中氯霉素不确定度评定Evaluation of Uncertainty of Chloramphenicol in Animal-Derived Food by LC/MS-MS◎ 陈均正1,2,3（1.广东省食品工业公共实验室，广东 广州 511442；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 511442；3.广东省食品质量监督检验站，广东 广州 511442）(1.Guangdong Provincial Public Laboratory of Food Industry, Guangzhou 511442, China;3.Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station, Guangzhou 511442, China)2.Guangdong Food Industry Institute Co., Ltd., Guangzhou 511442, China; Chen Junzheng1,2,3摘 要：根据GB/T 22338-2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》，通过高效液相色谱-串联质谱法对动物源性食品中氯霉素的测定过程进行分析，确定整个测定过程中影响结果的不确定度来源，对不确定度进行计算及分析，评定出测量结果的合成标准不确定度和扩展不确定度。当样品中氯霉素含量为1.84 mg·kg-1 时，取置信水平P=95%，扩展不确定度为0.151 mg·kg-1（k=2），其结果可表示为（1.84±0.151）mg·kg-1， 真实反映测量的置信度和准确性，为采用高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中氯霉素类药物残留量得出的结果提供可靠的理论依据。关键词：动物源性食品；高效液相色谱-串联质谱法；氯霉素；不确定度评定Abstract：This experiment according to GB/T 22338-2008, analyse the determination process of chloramphenicol in animal-derived food by HPLC-MS, ensure the source of uncertainty affecting the results during the whole determination process, calculate and analyse the uncertainty, evaluate the combined standard uncertainty and expanded uncertainty P=95%, the expanded uncertainty is 0.151 mg·kg-1, the result can be expressed as (1.84±0.151) mg·kg-1, truly reflect of measurement results. When the content of chloramphenicol in the sample is 1.84 mg·kg-1, make the confidence level the confidence and accuracy of the measurement, provide a reliable theoretical evidence for the results of determination of chloramphenicol residues in animal-derived foods.中图分类号：R155.5Key words：Animal-derived foods; HPLC-MS; Chloramphenicol; Uncertainty evaluation作者简介：陈均正（19—），男，本科，助理工程师；研究方向为兽残类药物液相串联质谱检测。142/现代食品XIANDAISHIPINCopyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.󰀡Analysis󰀡and󰀡Testing分析检测氯霉素是一种人工合成的广谱抗生素[1]，能引起人再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿灰色综合征等疾病[2]。如果长期微量摄入含有氯霉素残留的食物，不仅能使大肠杆菌、沙门氏菌等菌株产生耐药性，而且还会造成机体正常菌群失调，从而感染各种疾病[3]。测量不确定度，简称不确定度，是根据所用到的信息，表征赋予被测量值分散性的非负参数[4]。不确定度的评定是测量结果的重要部分，反映了测量结果的可靠性以及检测过程中各项不确定度来源对测量结果的影响程度[5]。而RB/T 216-2017《检验检测机构资质认定能力评价食品复检机构要求》[6]也规定了食品复检结果应包括测量不确定度。因此本文根据 GB/T 22338-2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》[7]，对实验过程中各项不确定度来源进行分析计算与归纳，找到了实验过程中不确定度产生的原因，以及应该从何处入手减少实验过程中产生的不确定度，为控制及减少实验过程中所产生的不确定度提供了参考依据。再加入30 mL乙腈，振摇3 min，离心5 min，取上清液转移至同一分液漏斗，振荡5 min，静置分层，转移乙腈层至同一棕色心形瓶中。向心形瓶中加入5 mL正丙醇，于40 ℃水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加 5 mL丙酮-正己烷溶解残渣。1.2.2 净化用5 mL丙酮-正己烷淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将残渣溶解溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5 mL丙酮-正己烷洗脱，收集洗脱液于心形瓶中，40 ℃水浴中旋转蒸发近干，氮气吹干，用1 mL一级水定容，定溶液过0.45 μm滤膜至进样瓶，待测定。1.2.3 标准工作液配制500.5 μg·mL-1氯霉素标准储备液：准确称取12.53 mg氯霉素，用乙腈溶解，并定容到25 mL容量瓶中。4 ℃下避光保存可使用6个月。1.001 μg·mL-1氯霉素标准中间液：吸取0.02 mL氯霉素标准储备液置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度。4 ℃下避光保存可使用1个月。氯霉素标准使用液：分别准确吸取氯霉素标准中间液0.005、0.050、0.100、0.500 mL和1.000 mL于 5个10 mL棕色容量瓶中，各加入氯霉素-D5内标溶液0.100 mL，用一级水定容至刻度，混匀。此氯霉素标准使用液浓度分别为0.500 5、5.005、10.01、50.05 ng·mL-1 和100.1 ng·mL-1。1.2.4 色谱条件色谱柱：Kinetex-C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）； 柱温：40 ℃；流动相：A为水、B为乙腈；流速： 0.4 mL·min-1；进样量：10 μL。梯度洗脱，洗脱方式如表1所示。表1 梯度洗脱程序表时间/min0.001.003.504.004.015.00B浓度5%5%95%95%5%5%A浓度95%95%5%5%95%95%1 材料与方法1.1 材料与仪器氯霉素标准品（纯度≥99.9%）、氯霉素-D5、甲醇、乙腈、丙酮、正丙醇、正己烷、LC-Si固相萃取柱、一次性注射式滤器、0.45 μm微孔滤膜。高效液相色谱-串联质谱仪、高速组织捣碎机、均质器、旋转蒸发仪、分析天平、移液、棕色心形瓶、分液漏斗、聚四氟乙烯离心管、离心机、漩涡混合器、固相萃取装置。1.2 试验方法1.2.1 提取称取试样5 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入100 μL氯霉素-D5工作溶液和30 mL乙腈，匀浆，离心5 min。将上清液移入250 mL分液漏斗，加入15 mL乙腈饱和的正己烷，振荡5 min，静置分层，转移乙腈层至100 mL棕色心形瓶中。残渣中XIANDAISHIPIN现代食品/143Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.分析检测Analysis and Testing2 结果与分析2.1 数学模型高效液相色谱-质谱/质谱法测定试样中氯霉素残留量采用标准曲线法定量，定量结果按公式（1）计算：由标准物质证书可知，氯霉素标准物质的不确定度为0.5%，按照矩形分布，其相对不确定度为：urel(P)=0.5%=2.×10−33×99.9%2.3.1.2 标准物质称量引起的相对不确定度分量urel(m1)氯霉素标准物质由十万分之一电子天平称量，氯霉素-D5标准物质已配制好为液体，无需称量。根据十万分之一电子天平鉴定证书，最大允差为±0.05 mg， 称取氯霉素标准物质12.53 mg，按矩形分布计算，其相对不确定度为：C×VX= W（1）式（1）中，X-试样中氯霉素的残留量，单位为μg·kg-1；C-从标准工作曲线上得到的被测组分浓度，单位为ng·mL-1；V-试样定容体积，单位为mL；W-样品称样量，单位为g。urel(m1)=2.2 不确定度来源分析[8-15]从数学模型、测定原理及方法分析，不确定度来源如图1所示。用高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中氯霉素残留量的不确定度来源主要有标准溶液配制产生的不确定度、前处理过程中产生的不确定度和仪器测量产生的不确定度。0.05=2.30×10−33×12.532.3.1.3 配制氯霉素标准溶液过程中所用器量引起的相对不确定度分量urel(V1)配制氯霉素标准溶液所用玻璃量具经鉴定均为A级，按照《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196-2006），用最大允差计算不确定度，按矩形分布进行计算。配制氯霉素标准溶液过程中所用的器量引起的相对不确定度如表2所示。表2 配制氯霉素标准溶液过程中所用的器量引起的相对不确定度表使用器具25 mL容量瓶10 mL容量瓶1 000 μL移液最大允差相对不确定度±0.030 mL0.030÷(3×25)=6.93×10-4±0.020 mL0.020÷(3×10)=1.15×10-3±10 μL±2 μL±0.8 μL±0.8 μL10÷(3×1 000)=5.77×10-32÷(3×200)=5.77×10-30.8÷(3×20)=2.31×10-20.4÷(3×10)=2.31×10-2图1 不确定度来源鱼骨图200 μL移液20 μL移液10 μL移液2.3 标准不确定度分量评定2.3.1 配制氯霉素标准溶液产生的相对不确定度ucrel(S)（B类不确定度）2.3.1.1 标准物质引起的相对不确定度分量urel(P)配制氯霉素标准溶液过程中所用器量引起的相对不确定度urel(V1)为：urel(V1)=(6.93×10)+(1.15×10)+(5.77×10)+(5.77×10)+(2.31×10)+(2.31×10)−42−32−32−32−22−22 =3.37×10-22.3.1.4 温度系数引起的相对不确定度分量urel(T1)氯霉素标准储备液、氯霉素标准中间液均在144/现代食品XIANDAISHIPIN（20±4）℃条件下进行配制，定容溶剂为乙腈，乙腈的体积膨胀系数为1.37×10-3 ℃-1；氯霉素标准使用液Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.󰀡Analysis󰀡and󰀡Testing分析检测在（20±4）℃条件下进行配制，定容溶剂为一级水，一级水的体积膨胀系数为2.1×10-4 ℃-1，按照矩形分布，配制氯霉素标准溶液过程中温度系数引起的相对不确定度如表3所示。表3 配制氯霉素标准溶液过程中温度系数引起的相对不确定度表使用器具10 mL容量瓶体积膨胀系数1.37×10-3 ℃-1相对不确定度10×4×1.37×10−3=3.16×10−33×1010 mL容量瓶2.1×10 ℃-4-110×4×2.1×10−4=4.85×10−43×10配制氯霉素标准溶液过程中温度系数引起的相对不确定度urel(T1)为：urel(T1)=(3.16×10)+(4.85×10)−32−42=3.20×10−3配制氯霉素标准溶液产生的相对不确定度ucrel(S)为：ucrel(S)=u2rel(P)+u2rel(m1)+u2rel(V1)+u2rel(T1) =(2.×10−3)+(2.30×10−3)+(3.37×10−2)+(3.20×10−3)=3.41×10−2最终定容体积时，用200～1 000 μL移液移取1 000 μL水进行定容，200～1 000 μL移液最大允差为±10 μL，按照矩形分布，其相对不确定度为：urel(V2)=10=5.77×10−3 3×100022222.3.2 样品处理过程中产生的相对不确定度ucrel(Q)（B类不确定度）2.3.2.1 样品称量引起的相对不确定度分量urel(m2)和urel(m3)根据称量所用的万分之一电子天平的鉴定证书，最大允差为±5 mg，样品及平行样称量值分别为5 034 mg 和5 014 mg，按照矩形分布，其相对不确定度为：2.3.2.3 温度系数引起的相对不确定度分量urel(T2)样品在（20±4）℃条件下进行定容，水的体积膨胀系数为2.1×10-4 ℃-1，按照矩形分布计算，其相对不确定度为：5urel(m2)==5.73×10−43×5 0345urel(m3)==5.76×10−43×5 01 42.3.2.2 前处理过程所用器量引起的相对不确定度分量urel(V2)1000 ×4×2.1×10−4urel(T2)==4.85×10−43×1 000样品处理过程中产生的相对不确定度ucrel(Q)的为：ucrel(Q)=u2rel(m2)+u2rel(m3)+u2rel(V2)+u2rel(T2) =(5.73×10)+(5.76×10)+(5.77×10)+(4.85×10)−42−42−32−42=5.85×10−3XIANDAISHIPIN现代食品/145Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.分析检测Analysis and Testing2.3.3 仪器测量结果产生的不确定度ucrel(M)（A类不确定度）2.3.3.1 测量结果重复性偏差引起的相对不确定度分量urel(x)测定样品6次，测定结果及计算数据见表4。表4 样品重复性测定结果表样品123456平均值氯霉素/ng·mL-191.791.791.691.691.791.691.65urel(x)=∑(x−x)i=1in=62n(n−1)=3.16×10−22.3.3.2 标准曲线拟合的标准偏差引起的相对不确定度分量urel(y)将氯霉素标准系列溶液测定3次，得到氯霉素标准系列溶液与氯霉素-D5标准系列溶液峰面积之比，以氯霉素标准系列溶液浓度与氯霉素-D5标准系列溶液浓度之比为X坐标，氯霉素标准系列溶液与霉素-D5标准系列溶液峰面积之比作为Y坐标，用最小二乘法拟合求出一元回归方程及相关系数，计算结果见表5。表5 氯霉素标准系列溶液3次测定的结果表氯霉素标准系列溶液浓度与氯霉素-D5标准系列溶液浓度之比0.050 050.500 51.0015.00510.01氯霉素标准系列溶液与氯霉素 -D5标准系列溶液峰面积之比10.040 120.345 40.69203.3606.47520.042 370.344 50.694 83.2616.46330.042 980.343 70.680 13.3176.4610.041 830.344 50.688 93.3136.4660.065 390.356 00.678 93.2626.492平均值拟合值采用最小二乘法拟合浓度-峰面积之比的标准工作曲线，线性回归方程为Y=0.5 2X+0.033 1，相关系数R=0.999 9（大于0.995），符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》标准要求，表明：氯霉素标准系列溶液与氯霉素-D5标准系列溶液峰面积之比和氯霉素标准系列溶液浓度与氯霉素-D5标准系列溶液浓度之比具有显著的线相关性。根据贝塞尔公式，标准曲线的剩余标准差SR为：nm2.3.3.3 回归系数斜率a的不确定度urel(a)urel(a)=SR∑(i=1nxi−x)2=0.036 39=4.30×10−38.4632.3.3.4 回归系数截距b的不确定度urel(b)urel(b)=SR×∑xi=1ni=1ni2m×n×∑xi−x()2SR=urel(y)= =∑∑(yi=1j=1ij−yi)2m×n−2 =0.036 39×126.5=1.25×10−23×5×71.620.017 21=3.×10−23×5−22.3.3.5 仪器测量结果引起的不确定度由于urel(x)、urel(y)、urel(a)、urel(b)之间相互不相关，根据公式：式中：yij-仪器各点峰面积之比；yi-回归直线计算值；n-测量点数，n=5；m-每个测量点重复测量次数，m=3。∂fu(x)=∑()uc2(yi)i=1∂yi2cn2146/现代食品XIANDAISHIPINCopyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.󰀡Analysis󰀡and󰀡Testing分析检测式中：ci=∂f-灵敏系数；uc(yi)-不确定度分量。∂yiC(a)=C(b)=∂x y−b2.171−0.0331=−2=−=-5.14∂aa0.5 22∂x11=−=−=-1.55∂ba0.5 2按照不确定度传播律进行合成，需先得出传播系数，对线性方程y=ax+b求偏导知：C(y)=∂x11===1.55∂ya0.5 2n仪器测量结果引起的相对不确定度为：ucrel(M)=∑ci2u2i=1 =(3.16×10−2)+(1.55×3.×10−2)+(−5.14×4.30×10−3)+(−1.55×1.25×10−2)3.312222 =2.15×10−22.3.4 总合成相对不确定度ucrel(X)222ucrel(X)=urel(S)+urel(Q)+urel(M)留量测定的不确定度评估[J].化学分析计量，2010，19（3）：7-10.−22 =(3.41×10)+(5.85×10)+(2.15×10)−22−32[2]王新丽.LC-MS/MS法测定鱼肉中氯霉素残留[J].中国卫生检验杂志，2007，17（3）：456-457.[3]宗万里，鲁 刚.基于液相色谱-串联质谱法的鱼肉中氯霉素残留量测定[J].成都大学学报（自然科学版），2016，35（1）：27-29.[4]国家质量监督检验检疫局.JJF 1059.1-2012 测量不确定度评定与表示[S].北京：中国质检出版社，2013.[5]孙久龙，张 悦，牛 燕，等.出口肉及肉制品中氯霉素残量检验方法不确定度评估[J].分析试验室，2009，28（S2）：331-334.[6]中国国家认证认可监督管理委员会.RB/T 216-2017 检验检测机构资质认定能力评价食品复检机构要求[S].北京：中国标准出版社，2018.[7]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 22338-2008 动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定[S].北京：中国标准出版社，2008. =4.1%2.4 扩展不确定度的评定由总合成相对不确定度的计算中可得知，高效液相色谱-串联质谱法对动物源性食品中氯霉素的测定实验过程中，标准溶液配制产生的不确定度和仪器测量产生的不确定度对总合成相对不确定度影响较大，而前处理过程中产生的不确定度对总合成相对不确定度影响较小，为控制及减少高效液相色谱-串联质谱法对动物源性食品中氯霉素的测定实验所产生的不确定度提供了参考依据。实验测得样品中氯霉素含量为1.84 mg·kg-1，假设测量过程中测量误差属于正态分布，取置信水平P=95%，包含因子k=2，则扩展不确定度UP=kp×urel=2×4.1%×1.84 mg·kg-1=0.151 mg·kg-1。3 结论当样品中氯霉素含量为1.84 mg·kg时，取置信水平P=95%（k=2），则其扩展不确定度可以表示为（1.84±0.151）mg·kg-1（k=2）。参考文献：[1]黄超群，刘海山，谢 文，等.蜂蜜中氯霉素残-1[8]宋正启，汪瑞俊，董 松.离子色谱法测定饮用水中溴酸盐的不确定度评定[J].广州化工，2014，42（13）：120-122.[9]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 27404-2008 实验室XIANDAISHIPIN现代食品/147Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.分析检测Analysis and Testing质量控制规范 食品理化检测[S].北京：中国标准出版社，2008.[10]曹宏燕.分析测试中的测量不确定度及评定第二部分 测量不确定度评定的基本方法[J].冶金分析，2005（2）：84-87.[11]曹宏燕.分析测试中测量不确定度及评定第三部分 分析测试中主要不确定度分量的评定[J].冶金分析，2005（3）：82-87.[12]曹宏燕.分析测试中测量不确定度及评定第四部分 实例（4）：标准溶液配制、标定及稀释的不确定度评定[J].冶金分析，2006（1）：79-85.[13]何志明.电感耦合等离子体原子发射光谱法测定低合金钢中铜的不确定度评定[J].冶金分析，2009，29（10）：76-80.[14]国家质量监督检验检疫总局．JJG 196-2006 常用玻璃量器检定规程[S].北京：中国标准出版社，2006．[15]谭波涛，郝媛媛.GC-MS法测定发酵食品中氨基甲酸乙酯含量的测量不确定度评定[J].化学分析计量，2011，20（5）：7-10.（上接第141页）2.9.3 霉菌霉菌是“发霉的真菌”，当食品处于潮湿环境中易发生霉变，产生霉菌，而一些霉菌的代谢产物有一定的毒性，比如黄曲霉毒素就是黄曲霉、寄生曲霉产生的代谢产物，有剧毒，可致癌。因此，检测霉菌这一指标有利于监督企业的卫生状况，从表2可以看出，抽检的样品中有一批次样品的霉菌超标，可能是由使用发霉的原料导致的，这样的食品是不能食用的，否则会影响身体健康。2.9.4 沙门氏菌沙门氏菌是一种食源性致病菌，感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便感染食品后，能使食用被感染食品的人发生食物中毒。肉制品、蛋类和家禽是沙门氏菌的主要传播媒介，对易感染沙门氏菌的食品进行分类管理、严格控制可有效降低沙门氏菌感染的概率。从表2可以看出，抽检的样品中，沙门氏菌这一项均 合格。2.9.5 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌是一种致病菌，在自然界中无处不在，空气、土壤、水中均有分布。金黄色葡萄球菌可感染的食品种类也很多，如蛋、奶、肉制品等。人类化脓感染中最常见的致病菌就是金黄色葡萄球菌，国内外关于金黄色葡萄球菌感染的事例也时常报道。所以，预防金黄色葡萄球菌感染也是国内外关注的焦点。从表2可以看出，抽检的样品中，金黄色葡萄球菌这一项均合格。148/现代食品XIANDAISHIPIN表2 抽检样品中的微生物检查情况表检验项目菌落总数大肠菌群霉菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌合格样品/批次20420420388不合格样品/批次00100合格率/%10010099.51001003 结论与讨论通过对山楂制品中常用的食品添加剂（防腐剂、着色剂、甜味剂）和微生物指标进行分析，了解到承德市山楂企业对于添加剂的使用，是严格按照国家标准进行的，消费者可以放心食用。在卫生质量方面，存在使用发霉的原料或者生产车间环境不达标导致霉菌超标的情况，建议消费者选择规模较大的食品企业生产的产品或者到规模大一点的超市进行选购，在质量上有保障，不要贪图便宜买一些小作坊生产的产品。参考文献：[1]吕玲霞，辛立红，管仁伟，等.山楂多糖药理作用和提取工艺发展[J].药物评价研究，2016，39（6）：1081-1085.[2]王 玲，吴军林，吴清平，等.山楂降血脂作用和机理研究进展[J].食品科学，2014，36（15）：245-248.[3]董银萍，李拖平.山楂果胶的抗氧化活性[J].食品科学，2013，35（3）：29-32.[4]黄 镁.食品中二氧化硫残留量的控制和检测[J].中国高新技术企业，2010（25）：38-39.Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. 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