(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 109207469 A(43)申请公布日 2019.01.15
(21)申请号 201811109813.9(22)申请日 2018.09.21
(71)申请人 山东泓达生物科技有限公司
地址 2700 山东省临沂市沂水县工业园(72)发明人 韩龙 马杰希 阮国祥 陈凯庆 (74)专利代理机构 青岛高晓专利事务所(普通
合伙) 37104
代理人 黄晓敏(51)Int.Cl.
C12N 13/00(2006.01)C12N 15/01(2006.01)C12N 1/20(2006.01)C12P 19/42(2006.01)C12R 1/38(2006.01)
权利要求书2页 说明书5页 附图3页
CN 109207469 A(54)发明名称
一种高产维生素B12的突变菌株制备方法(57)摘要
本发明属于生物工程中的菌种制备技术领域，涉及一株高产维生素B12成分的突变菌株及工业发酵技术,特别是一种高产维生素的突变菌株的生产培育方法；涉及的脱氮假单胞菌的具体诱变工艺步骤包括：出发菌悬液制备、诱变、菌落计数、菌株初筛和菌株复筛；其通过对原始菌株进行诱变后，再次通过常温常压等离子体（ARTP）诱变技术对一株具有典型诱变特征的菌株进行了诱变，最终获得遗传性质稳定、发酵水平较高的菌种；涉及的突变菌株TP-121实现工业发酵生产维生素B12的方法包括如下步骤：种瓶制备、种子罐培养和发酵罐培养；其工艺原理可靠，操作步骤简单，技术条件成熟，菌种优质，维生素产量高，应用环境友好。
CN 109207469 A
权 利 要 求 书
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1.一种高产维生素B12的突变菌株制备方法，其特征在于涉及的脱氮假单胞菌的具体诱变工艺步骤如下：（1）出发菌悬液制备：取两株出发菌株的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为107-108个/mL，制得出发菌悬液；（2）诱变：开启常温常压等离子出发系统，以酒精棉擦拭操作室内外空间，并开启紫外灯灭菌30min，灭菌结束后取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上；开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变；诱变时间分别设定为90s、120s、150s、180s、210s；（3）菌落计数：每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1min；稀释涂布后置于30+2℃，50+5%相对湿度下培养5天，对长出的单菌落进行观察计数；（4）菌株初筛：从各处理组分分别挑取20个单菌落进行斜面传代以及后续的摇瓶初筛；（5）菌株复筛：从初筛结果中选出效价高的突变菌株，经反复多次复筛，选出前10%的突变菌株再进行复筛，复筛时一株作三个平行，对挑选出的典型诱变菌株，逐一进行发酵摇瓶考察，选择起步效价、放瓶单位和菌浓均较高的菌种，即为含有生产维生素B12的突变菌株。
2.根据权利要求1所述的高产维生素B12的突变菌株制备方法，其特征在于涉及的筛选平板和传代斜面的培养基组成包括：甜菜糖蜜7.0-9.0%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌0.5%，磷酸氢二铵2.75%和琼脂1.2-1.5g/L，其余为水，除已经标注的外，各浓度均为重量百分比浓度；其pH值为7.0-7.5。
3.根据权利要求1所述的高产维生素B12的突变菌株制备方法，其特征在于涉及的菌株初筛中筛选种瓶用的培养基组成重量百分比包括：甜菜糖蜜5.0-7.0%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌1.2%，氯化钴0.05%，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）0.05%和磷酸氢二铵2.75%，其余的为水，其pH值为7.0-7.5。
4.根据权利要求1所述的高产维生素B12的突变菌株制备方法，其特征在于涉及的菌株复筛中的筛选摇瓶的培养基重量百分比组成包括：甜菜糖蜜8.0-11.0%，蔗糖1.8%，氯化胆碱1.5%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌1.2%，氯化钴0.05%，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）0.05%，尿素0.05%和磷酸氢二铵2.75%，其余为水，其pH7.0-7.5。
5.一种突变菌株TP-121实现工业发酵生产维生素B12的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）种瓶制备：将斜面菌用无菌水洗下后接入种瓶培养，30℃，200rpm，发酵2d，发酵结束后将种子液收集到3L的无菌瓶中，得到种子罐的种瓶；（2）种子罐培养：将种瓶接种到种子罐中，30℃，180-300rpm，发酵48h；（3）发酵罐培养：在无菌条件下，按照8％的接种量，将种子罐发酵液压入发酵罐，进行发酵罐培养；30℃，180-300rpm，发酵至60h后控制溶氧20％-30％，40h开始补料，发酵至菌体自溶严重，单位无明显提高时放罐；
其中，种子培养基质量百分比组成如下：糖蜜10%-12%，硫酸铵2.0%-2.5%，磷酸氢二铵0.5%-1.0%，硫酸锰0.1%-0.2%，硫酸镁1.2%-1.5%，硫酸锌0.5%-0.8%，其余为水，pH7.0-7.5；
发酵培养基质量百分百组成如下：糖蜜12％-15％，（NH4)2HPO40.5％-1％，硫酸铵1％-2
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2％，氯化钴0.03％，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）0.1％-0.15％，甜菜碱2％-3％，硫酸镁2.0%-3.0%，碳酸钙1.0-1.5%，其余为水，pH7.0-7.5；
补料培养基以糖蜜或葡萄糖作为补料碳源，其总糖浓度为150-200g/L。
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说 明 书
一种高产维生素B12的突变菌株制备方法
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技术领域：
本发明属于生物工程中的菌种制备技术领域，涉及一株高产维生素B12成分的突变菌株及工业发酵技术,特别是一种高产维生素的突变菌株的生产培育方法。[0002]背景技术：
维生素B12，又称钴胺素，是一系列含有以钴原子为中心的咕啉核和以5，6-二甲基苯并咪唑为碱基的核苷酸且对人和动物具有生物活性的咕啉累有机化合物的总称；维生素B12的化学结构如图1所示；目前主要通过利用费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）和谢氏丙酸杆菌（Propionibacterium shermanii）的厌氧发酵以及利用脱氮假单胞菌（Pseudomonas denitrificans）进行的好氧发酵实现VB12的工业生产。近几十年来，世界各国科研和生产工作者们为了提高维生素B12的发酵式生产水平进行了不懈努力；如中国专利CN102453690A公布了一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12高产菌株的诱变方法，通过化学诱变和低能离子注入诱变筛选获得一株突变菌种，使得发酵单位提高8-12%；中国专利号为CN101538599A的发明专利公开了一种利用最适的甜菜碱初始添加量和最适的甜菜碱补料量提高脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的方法；中国专利号CN101748177的发明专利公布了一种通过调整培养基中的钾离子浓度优化脱氮假单胞菌的发酵生产工艺，并对合成培养基进行了系统优化使得发酵单位有所提高。尽管这些现有技术和研究新成果也已经达到了一定的技术水平，生产的维生素质量也很好，但是利用诱变、DNA重组技术或其他新工艺方法获得优良菌株，提高维生素B12基因在受体菌中的表达水平，进一步优化维生素B12的发酵和提取工艺以及保存条件，仍然是维生素B12在各行业领域进行广泛探讨和应用的重要任务。[0003]发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种高产维生素B12的突变菌株的工业发酵方法，将其制备的突变菌株应用于工业生产中制取维生素B12。[0004]为了实现上述目的，本发明的工艺技术中所述的高产维生素B12的菌株为脱氮假单胞菌(Aspergillus niger)TP-121，是由脱氮假单胞菌TY-007通过常温常压等离子体（ARTP）诱变筛选获得的高产菌株，其菌株形态特征在于镜检菌丝较短，菌形排列一致，着色较深，摇瓶后期菌丝拉长产生膨大端；其中，脱氮假单胞菌TY-007是一株经紫外诱变筛选得到的高产维生素B12菌株，其发酵水平较原始菌提高了10.8%，该菌经液体培养后菌丝较长，易相互缠绕，致使发酵液粘稠，不利于发酵后期的传质和传氧，也不利于提取工段操作，将其作为出发菌种再次诱变；本菌种的最适生长温度为30℃，生长所需的pH范围为7.3-7.5；所述脱氮假单胞菌株TP-121所产维生素B12达到320-350ug/mL。[0005]本发明涉及的脱氮假单胞菌的具体诱变工艺步骤如下：
（1）出发菌悬液制备：取两株出发菌株的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为107-108个/mL，制得出发菌悬液；
（2）诱变：开启常温常压等离子出发系统，以酒精棉擦拭操作室内外空间，并开启紫外
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灯灭菌30min，灭菌结束后取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上；开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变；诱变时间分别设定为90s、120s、150s、180s、210s；
（3）菌落计数：每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1min；稀释涂布后置于30+2℃，50+5%相对湿度下培养5天，对长出的单菌落进行观察计数；
（4）菌株初筛：从各处理组分分别挑取20个单菌落进行斜面传代以及后续的摇瓶初筛；（5）菌株复筛：从初筛结果中选出效价高的突变菌株，经反复多次复筛，选出前10%的突变菌株再进行复筛，复筛时一株作三个平行，对挑选出的典型诱变菌株，逐一进行发酵摇瓶考察，选择起步效价、放瓶单位和菌浓均较高的菌种，即为含有生产维生素B12的突变菌株。[0006]本发明所述的诱变技术方案中涉及的筛选平板和传代斜面的培养基组成包括：甜菜糖蜜7.0-9.0%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌0.5%，磷酸氢二铵2.75%和琼脂1.2-1.5g/L，其余为水，除已经标注的外，各浓度均为重量百分比浓度；其pH值为7.0-7.5。
[0007]本发明涉及的菌株初筛中筛选种瓶用的培养基组成重量百分比包括：甜菜糖蜜5.0-7.0%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌1.2%，氯化钴0.05%，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）0.05%和磷酸氢二铵2.75%，其余的为水，其pH值为7.0-7.5。
[0008]本发明涉及的菌株复筛中的筛选摇瓶的培养基重量百分比组成包括：甜菜糖蜜8.0-11.0%，蔗糖1.8%，氯化胆碱1.5%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌1.2%，氯化钴0.05%，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）0.05%，尿素0.05%和磷酸氢二铵2.75%，其余为水，其pH7.0-7.5。
[0009]本发明所述的突变菌株TP-121实现工业发酵生产维生素B12的方法包括如下步骤：
（1）种瓶制备：将斜面菌用无菌水洗下后接入种瓶培养，30℃，200rpm，发酵2d，发酵结束后将种子液收集到3L的无菌瓶中，得到种子罐的种瓶；
（2）种子罐培养：将种瓶接种到种子罐中，30℃，180-300rpm，发酵48h；（3）发酵罐培养：在无菌条件下，按照8％的接种量，将种子罐发酵液压入发酵罐，进行发酵罐培养；30℃，180-300rpm，发酵至60h后控制溶氧20％-30％，40h开始补料，发酵至菌体自溶严重，单位无明显提高时放罐；
其中，种子培养基质量百分比组成如下：糖蜜10%-12%，硫酸铵2.0%-2.5%，磷酸氢二铵0.5%-1.0%，硫酸锰0.1%-0.2%，硫酸镁1.2%-1.5%，硫酸锌0.5%-0.8%，其余为水，pH7.0-7.5；
发酵培养基质量百分百组成如下：糖蜜12％-15％，（NH4)2HPO40.5％-1％，硫酸铵1％-2％，氯化钴0.03％，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）0.1％-0.15％，甜菜碱2％-3％，硫酸镁2.0%-3.0%，碳酸钙1.0-1.5%，其余为水，pH7.0-7.5；
补料培养基以糖蜜或葡萄糖作为补料碳源，其总糖浓度为150-200g/L。[0010]本发明与现有技术相比，通过对原始菌株进行诱变后，再次通过常温常压等离子体（ARTP）诱变技术对一株具有典型诱变特征的菌株进行了诱变，最终获得遗传性质稳定、发酵水平较高的菌种，再经过培养基优化和发酵工艺条件优化，建立了液体发酵维生素B12的方法；所制备菌种的最适生长温度为30℃，生长所需的pH范围为7.0-7.5，发酵至144h左
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右达到最大菌浓，比原始菌株同时期菌浓提高了16.5%；与另两种菌株相比，对数期由原先的120h左右，缩短至96h左右，为后期产B12奠定了基础；该菌株最终发酵单位达到315ug/mL，明显高于原始菌株，大大降低了生产成本；其工艺原理可靠，操作步骤简单，技术条件成熟，菌种优质，维生素产量高，应用环境友好。[0011]附图说明：
图1为本发明涉及的维生素B12的分子化学结构示意图。[0012]图2为本发明涉及的不同菌株的发酵水平曲线示意图。[0013]图3为本发明涉及的常温常压等离子体（ARTP）诱变致死曲线示意图。[0014]图4为本发明涉及的发酵过程菌浓变化曲线示意图。
[0015]图5为本发明涉及的发酵过程中维生素B12单位变化曲线示意图。[0016]具体实施方式：
以下通过具体实施例并结合附图对本发明做更详细的说明。[0017]实施例1：
本施实例涉及一种突变菌株的诱变选育，其具体工艺步骤为：（1）取两株出发菌株的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为107-108个/mL，以此作为出发菌悬液；
（2）开启常温常压等离子系统，以酒精棉擦拭操作室内外，并开启紫外灯灭菌30min；灭菌结束后取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上；开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变；诱变时间分别设定为90s、120s、150s、180s、210s；
（3）每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1min；稀释涂布后置于30+2℃，50+5%相对湿度下培养5天；对长出的单菌落进行观察计数；
（4）筛选平板和传代斜面的培养基组成如下：甜菜糖蜜7.0%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌0.5%，磷酸氢二铵2.75%，琼脂1.2-1.5g/L，其余为水，pH7.0-7.5；
其中，筛选种瓶的培养基组成如下：甜菜糖蜜7.0%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌1.2%，氯化钴0.05%，DMBI0.05%，磷酸氢二铵2.75%，其余为水，pH7.0-7.5；
筛选摇瓶的培养基组成如下：甜菜糖蜜8.0%，蔗糖1.8%，氯化胆碱1.5%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌1.2%，氯化钴0.05%，DMBI0.05%，尿素0.05%，磷酸氢二铵2.75%，其余为水，pH7.0-7.5；
菌株初筛：从各处理组分分别挑取20个单菌落进行斜面传代以及后续的摇瓶初筛；菌株复筛：从初筛结果中选出效价高的突变株，经反复多次复筛，选出前10%的突变株再进行复筛，复筛时一株作三个平行，对挑选出的典型诱变菌株，逐一进行发酵摇瓶考察，选择起步效价、放瓶单位和菌浓均较高的菌种；复筛摇瓶发酵7天后放瓶，筛选出5株具有较高发酵单位的突变株，列表如下：菌株原始菌株TY-007TP-21TP-28TP-45TP-72TP-121发酵单位（ug/mL）212235256252250252268
经再次的摇瓶发酵后选育出TP-121为稳定的最高酶活菌株形态特征观察：镜检该菌丝较短，菌形排列一致，着色较深，摇瓶后期菌丝拉长产生膨大端。
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实施例2：
本施实例涉及一种利用突变菌株的液体发酵生产维生素B12的具体工艺：（1）斜面培养：将所述TP-121取一接种环菌苔接种于斜面培养基中，30℃培养3d；（2）种瓶培养：挖取斜面菌块接种于种瓶培养基中，30℃，200rpm，培养2d；（3）种子罐培养：将种瓶发酵后的种子液合瓶按照接种量5%的比例接入种子罐，30℃，180-300rpm，发酵48h；
（4）发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量8%的比例接入发酵罐，30℃，180-300rpm，发酵至60h后控制溶氧20％-30％，40h开始补料，发酵至菌体自溶严重，单位无明显提高时放罐，发酵周期为200h-240h；下表是50L发酵罐6批次的发酵情况，平均发酵水平为311.88ug/mL；批次发酵周期（h）发酵活力（ug/mL）1225307.252236315.623217309.634232312.565213305.876231320.36
斜面培养基配制如下：甜菜糖蜜7.0%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌0.5%，磷酸氢二铵2.75%，琼脂1.2-1.5g/L，其余为水，pH7.0-7.5；
种子培养基质量体积百分比组成如下：糖蜜10%，硫酸铵2.0%，磷酸氢二铵1.0%，硫酸锰0.1%%，硫酸镁1.5%，硫酸锌0.8%，其余为水，pH7.0-7.5；
发酵培养基质量体积百分百组成如下：糖蜜15％，（NH4)2HPO40.5％，硫酸铵2％，氯化钴0.03％，DMBI0.1％，甜菜碱2％，硫酸镁2.0%，碳酸钙1.5%，其余为水，pH7.0-7.5；
补料培养基：以糖蜜或葡萄糖作为补料碳源，其总糖浓度均控制在150-200g/L。[0019]实施例3：
本实施例涉及维生素B12含量的测定方法，采用高效液相色谱法，发酵液中的既存在于胞内又存在于胞外,在测定发酵液中的时需要将菌体破碎,具体的操作步骤如下：
（1）样品制备
取发酵液,加入亚钠溶液和冰醋酸各,摇匀,于95-100℃水浴水浴后冷却至室温,加去离子水定容至,过滤所得滤液用林微孔滤膜针头过滤器过滤至样品瓶中,用微量进样器吸取溶液林放入样品瓶中,将样品瓶放入35-40℃水浴中反应1小时,使发酵液中不同形式的维生素转化为氰钻胺素,在给定条件下进行液相色谱分析；
（2）高效液相色谱条件
流动相为磷酸水溶液一乙睛,色谱柱为菲罗门，250mm×4.6mm，um；检测波长为361nm,进样量是20uL,流速为1.7mL/min；
色谱柱型号：C18；生产厂家：菲罗门；250mm×4.6mm；5um；检测波长：260nm，流速：1mL/min；进样量：10uL，柱温40℃；流动相：称取磷酸二氢钾（纯度99.5%）6.84g，置于1000mL容量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，用磷酸调节pH至3.2，摇匀，用0.45微米的微孔滤膜过滤得0.05mol/L的磷酸二氢
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钾溶液。将乙腈与0.05mol/L磷酸二氢钾溶液按150：850的比例混匀，放入超声水浴中脱气10min即可；
（3）线性及范围：
精密称取50mg至100mL棕色容量瓶中，加入纯化水溶解并稀释至刻度，混合均匀，得到标准贮备液500ug/mL。精密量取此标准贮备液5mL至50mL棕色容量瓶中，用纯化水稀释至刻度，混合均匀，作为标准品样液。
[0020]本实施例制备的菌株发酵后维生素B12的含量为320-350ug/mL，其提取收率为90%以上；所制备的维生素B12应用于医药、营养补充剂、饲料和食品加工等行业，可辅助治疗巨幼红细胞性贫血、药物中毒引起的贫血、再生障碍性贫血和白细胞减少症等；维生素B12还有维护神经髓鞘的代谢与功能，作为一些神经方面疾病或损伤的辅助治疗药物；在饲料行业中，维生素B12可以促进动物对蛋白质的利用和个体的生长，特别是幼小动物。
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