(19)中华人民共和国国家知识产权局
*CN103468666A*
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103468666 A(43)申请公布日 2013.12.25
(12)发明专利申请
(21)申请号 201310438814.9(22)申请日 2013.09.24
(71)申请人苏州昆蓝生物科技有限公司
地址215000 江苏省苏州市工业园区星湖街
218号生物纳米园A2楼229室(72)发明人刘宝龙 吴鹏 宋宵因 赵路
赵岩(74)专利代理机构北京联瑞联丰知识产权代理
事务所(普通合伙) 11411
代理人曾少丽(51)Int.Cl.
C12N 9/96(2006.01)C12N 9/50(2006.01)C12N 9/26(2006.01)
(54)发明名称
一种提高液体复合酶稳定性的方法(57)摘要
本发明属于生物技术领域，具体提供了一种提高液体复合酶稳定性的方法。该方法首先将69～72份酸性果胶酶与28～31份普鲁兰多糖（重量比）搅拌，然后再加入抗坏血酸钠以及脱氢乙酸，继续搅拌，得到酸性果胶酶混合液；然后将50-56份酸性蛋白酶与32-35份聚葡萄糖和12-15份海藻酸钠（重量比）搅拌，然后再加入抗坏血酸钠以及脱氢乙酸，继续搅拌，得到酸性蛋白酶混合液；最后将酸性果胶酶混合液和酸性蛋白酶混合液按重量比为1：1进行混匀，立即在30-40r/min转速下搅拌30-60min，得到终产品酸性果胶酶和酸性蛋白酶的液体复合酶。本发明提供的方法，可以使酸性果胶酶和酸性蛋白酶的液体复合酶在长期储存时或者同时使用时各自的酶活力不受影响，降低成本。
权利要求书1页 说明书6页权利要求书1页 说明书6页
CN 103468666 ACN 103468666 A
权 利 要 求 书
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1.一种提高液体复合酶稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将69～72份酸性果胶酶与28～31份普鲁兰多糖（重量比）在30-40r/min转速下搅拌20-30min，然后再加入占酸性果胶酶和普鲁兰多糖总重量0.1‰的抗坏血酸钠以及0.25‰的脱氢乙酸，继续在30-40r/min转速下搅拌30-60min，得到酸性果胶酶混合液；
（2）将50-56份酸性蛋白酶与32-35份聚葡萄糖和12-15份海藻酸钠（重量比）在30-40r/min转速下搅拌20-30min，然后再加入占酸性蛋白酶、聚葡萄糖和海藻酸钠总重量0.1‰的抗坏血酸钠以及0.25‰的脱氢乙酸，继续在30-40r/min转速下搅拌30-60min，得到酸性蛋白酶混合液；
（3）将步骤（1）所得酸性果胶酶混合液和步骤（2）所得酸性蛋白酶混合液按重量比为1：1进行混匀，立即在30-40r/min转速下搅拌30-60min，得到终产品酸性果胶酶和酸性蛋白酶的液体复合酶。
2.根据权利要求1所述的一种提高液体复合酶稳定性的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述酸性果胶酶为70份，所述普鲁兰多糖为30份。
3.根据权利要求1所述的一种提高液体复合酶稳定性的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述酸性蛋白酶为53份，所述聚葡萄糖为33份，所述海藻酸钠为14份。
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CN 103468666 A
说 明 书
一种提高液体复合酶稳定性的方法
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技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高液体复合酶稳定性的方法。
背景技术
酸性蛋白酶是一种催化蛋白质中肽键水解的酶类，而酸性果胶酶和酸性蛋白酶本
质上均为蛋白质，所以将酸性果胶酶和酸性蛋白酶复合在一起时，酸性蛋白酶本身会发生自溶现象，同时酸性蛋白酶也会降解酸性果胶酶，造成酸性果胶酶和酸性蛋白酶的酶活力急速下降。酸性果胶酶和酸性蛋白酶的复合酶在25℃下保存14天，即可造成酸性果胶酶和酸性蛋白酶的平均酶活力损失在87%以上。[0003] 另外，酸性蛋白酶降解蛋白质这一特性也造成了其使用过程中不能和酸性果胶酶同时使用，否则会很大程度上降低酸性果胶酶和酸性蛋白酶本身的应用效果。为了保证在使用过程中的应用效果，现行办法是将酸性蛋白酶与酸性果胶酶分开储存和使用，这就造成了储存和运输成本的增加，而且二者分开使用也造成了使用成本的增加。
[0002]
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种提高液体复合酶稳定性的方法。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：[0006] 本发明一种提高液体复合酶稳定性的方法，包括以下步骤：[0007] （1）将69～72份酸性果胶酶与28～31份普鲁兰多糖（重量比）在30-40r/min转速下搅拌20-30min，然后再加入占酸性果胶酶和普鲁兰多糖总重量0.1‰的抗坏血酸钠以及0.25‰的脱氢乙酸，继续在30-40r/min转速下搅拌30-60min，得到酸性果胶酶混合液；[0008] （2）将50-56份酸性蛋白酶与32-35份聚葡萄糖和12-15份海藻酸钠（重量比）在30-40r/min转速下搅拌20-30min，然后再加入占酸性蛋白酶、聚葡萄糖和海藻酸钠总重量0.1‰的抗坏血酸钠以及0.25‰的脱氢乙酸，继续在30-40r/min转速下搅拌30-60min，得到酸性蛋白酶混合液；[0009] （3）将步骤（1）所得酸性果胶酶混合液和步骤（2）所得酸性蛋白酶混合液按重量比为1：1进行混匀，立即在30-40r/min转速下搅拌30-60min，得到终产品酸性果胶酶和酸性蛋白酶的液体复合酶。[0010] 优选地，在步骤（1）中，所述酸性果胶酶为70份，所述普鲁兰多糖为30份。[0011] 优选地，在步骤（2）中，所述酸性蛋白酶为53份，所述聚葡萄糖为33份，所述海藻酸钠为14份。
[0012] 当酸性果胶酶混合液中普鲁兰多糖含量达到14%以上时，普鲁兰多糖可与酸性果胶酶的蛋白质分子形成完全可逆的三维空间结构，使酸性果胶酶的蛋白质分子得到抑制和钝化，形成了酸性果胶酶的钝化平衡体系，从而达到酸性果胶酶在此环境中暂时失去活性，从而保存酶活力的目的。
[0004]
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CN 103468666 A[0013]
说 明 书
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在工业生产（例如酿造果汁、果酒）过程中，酸性果胶酶的添加量一般为反应底物
的1-5‰，这样就使普鲁兰多糖的含量远远小于14%，又因为之前形成的是完全可逆的三维空间结构，因而当普鲁兰多糖的含量远远小于14%时，会完全释放出酸性果胶酶，从而不会影响酸性果胶酶的应用效果。
[0014] 酶参与催化降解作用的主要方式是通过酶分子的活性部位完成的，酶分子的活性部位被覆盖包裹后，酶就会掩蔽其催化降解的能力。当酸性蛋白酶中海藻酸钠含量超过6%时，酸性蛋白酶的活性部位就会被海藻酸钠完全覆盖包裹，从而使酸性蛋白酶暂时性失去催化降解作用。使用过程中致使海藻酸钠含量小于6%时就会破坏海藻酸钠覆盖包裹作用，从而释放出酸性蛋白酶的活性部位。这样即达到了酸性蛋白酶的自溶和降解复合酶中其他酶的作用，又不会影响到使用效果。
[0015] 聚葡萄糖是酸性蛋白酶的抑制钝化剂，当聚葡萄糖含量超过16%时就会和酸性蛋白酶的蛋白质分子形成稳定结构，从而保证酸性蛋白酶的稳定性。使用过程中破坏聚葡萄糖和酸性蛋白酶形成的稳定结构就会使酸性蛋白酶完全释放出来。[0016] 当复合酶溶液中添加0.1‰的抗坏血酸钠时，可以降低复合酶中溶解氧对酶分子的氧化破坏。
[0017] 复合酶溶液中添加0.25‰的脱氢乙酸，既可以调节复合酶溶液pH值，又可以达到防腐抑菌的作用。
[0018] 本发明所达到的有益效果是：[0019] （1）采用本发明的方法，可以使液体复合酶中酸性果胶酶和酸性蛋白酶活力在25-35℃条件下6个月内保持95%以上，可以使液体复合酶中酸性果胶酶和酸性蛋白酶活力在25-35℃条件下12个月内保持在88%以上，并且使用过程中不会降低酸性果胶酶和酸性蛋白酶对果胶和蛋白质的降解率。[0020] （2）在工业生产（例如酿造果汁、果酒）过程中，当同时使用酸性果胶酶和酸性蛋白酶时，可以有效地避免酸性蛋白酶降解酸性果胶酶，保证酸性果胶酶的酶活力不会受到影响。
具体实施方式
[0021] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。[0022] 实施例1[0023] （1）将690kg酸性果胶酶与310kg普鲁兰多糖在30r/min转速下搅拌20min，然后再加入0.1kg的抗坏血酸钠和0.25kg的脱氢乙酸，继续在30r/min转速下搅拌30min。得到酸性果胶酶混合液。[0024] （2）将560kg酸性蛋白酶与320kg聚葡萄糖和120kg海藻酸钠在30r/min转速下搅拌20min，然后再加入0.1kg的抗坏血酸钠和0.25kg的脱氢乙酸，继续在30r/min转速下搅拌30min。得到酸性蛋白酶混合液。[0025] （3）将（1）步所得酸性果胶酶混合液1000kg和（2）步所得酸性蛋白酶混合液1000kg进行混匀，即在30r/min转速下搅拌30min。得到终产品酸性果胶酶和酸性蛋白酶的液体复合酶（标记为复合酶1号样）。
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CN 103468666 A[0026]
说 明 书
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实施例2
[0027] （1）将700kg酸性果胶酶与300kg普鲁兰多糖在40r/min转速下搅拌30min，然后再加入0.1kg的抗坏血酸钠和0.25kg的脱氢乙酸，继续在40r/min转速下搅拌60min。得到酸性果胶酶混合液。[0028] （2）将500kg酸性蛋白酶与350kg聚葡萄糖和150kg海藻酸钠在40r/min转速下搅拌30min，然后再加入0.1kg的抗坏血酸钠和0.25kg的脱氢乙酸，继续在40r/min转速下搅拌60min。得到酸性蛋白酶混合液。[0029] （3）将（1）步所得酸性果胶酶混合液1000kg和（2）步所得酸性蛋白酶混合液1000kg进行混匀，即在40r/min转速下搅拌60min。得到终产品酸性果胶酶和酸性蛋白酶的液体复合酶（标记为复合酶2号样）。[0030] 实施例3[0031] （1）将720kg酸性果胶酶与280kg普鲁兰多糖在40r/min转速下搅拌30min，然后再加入0.1kg的抗坏血酸钠和0.25kg的脱氢乙酸，继续在40r/min转速下搅拌60min。得到酸性果胶酶混合液。[0032] （2）将530kg酸性蛋白酶与330kg聚葡萄糖和140kg海藻酸钠在30r/min转速下搅拌20min，然后再加入0.1kg的抗坏血酸钠和0.25kg的脱氢乙酸，继续在30r/min转速下搅拌30min。得到酸性蛋白酶混合液。[0033] （3）将（1）步所得酸性果胶酶混合液1000kg和（2）步所得酸性蛋白酶混合液1000kg进行混匀，即在40r/min转速下搅拌60min。得到终产品酸性果胶酶和酸性蛋白酶的液体复合酶（标记为复合酶3号样）。[0034] 实施例4[0035] （1）将690kg酸性果胶酶与310kg普鲁兰多糖在30r/min转速下搅拌20min，然后再加入0.1kg的抗坏血酸钠和0.25kg的脱氢乙酸，继续在30r/min转速下搅拌30min。得到酸性果胶酶混合液。[0036] （2）将500kg酸性蛋白酶与350kg聚葡萄糖和150kg海藻酸钠在40r/min转速下搅拌30min，然后再加入0.1kg的抗坏血酸钠和0.25kg的脱氢乙酸，继续在40r/min转速下搅拌60min。得到酸性蛋白酶混合液。[0037] （3）将（1）步所得酸性果胶酶混合液1000kg和（2）步所得酸性蛋白酶混合液1000kg进行混匀，即在40r/min转速下搅拌60min。得到终产品酸性果胶酶和酸性蛋白酶的液体复合酶（标记为复合酶4号样）[0038] 对比例1[0039] （1）将100kg酸性果胶酶和100kg酸性蛋白酶在40r/min转速下搅拌30min，得到酸性果胶酶和酸性蛋白酶的液体复合酶（标记为对比例1复合酶样）。[0040] 对比例2[0041] （1）在100ml各含5%果胶和蛋白质溶液中添加0.5ml酸性果胶酶，常温下处理30min。
[0042] （2）将步骤（1）处理后液体中再添加0.5ml酸性蛋白酶，常温下处理30min，检测剩余果胶和蛋白质的量。
[0043] 实施例与对比例检测结果如下：
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CN 103468666 A
说 明 书
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[0044] （1）将实施例与对比例1制得的复合酶分别取样保存在25℃和35℃条件下，每隔
一段时间对酶活力进行检测。
[0045] 表1在25℃条件下复合酶的酶活力保存率
[0046]
从表1中可以看出，对比例复合酶1号样第14天时酶活力仅剩原来的13%，失活非
常明显。经本发明稳定剂处理的复合酶在保存12个月后酶活力保存率仍在90%以上。[0048] 表2在35℃条件下复合酶的酶活力保存率
[0047] [0049]
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说 明 书
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从表2中可以看出，对比例复合酶1号样第14天时酶活力仅剩原来的9%，失活非
常明显。经本发明稳定剂处理的复合酶在保存12个月后酶活力保存率仍在88%以上。[0051] （2）分别取0.5mL实施例1、2、3、4和对比例1制得的复合酶对100mL各含5%果胶和蛋白质溶液进行30min的降解处理，与对比例2的处理方法进行果胶和蛋白质降解效果的对比，检测果胶和蛋白质的降解率。[0052] 表3果胶和蛋白质的降解率
[0050] [0053]
[0054]
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CN 103468666 A
说 明 书
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从表3中可以看出，实施例与分步降解的对比例2对果胶和蛋白质的降解率几乎
相同，并没有因为同时添加酸性果胶酶和酸性蛋白酶而造成对果胶和蛋白的降解率的下降，相反的是对比例1的果胶降解率仅为22%，明显低于其他组别，蛋白酶的影响虽然较小，但是蛋白质降解率也较其他组别减少了10%。[0056] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0055]
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