紫杉醇聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒制备研究

陈如大;任非;李国锋;刘思佳

【摘 要】目的 评价紫杉醇聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(PTX-PBCA-NPs)的不同制备工艺对紫杉醇的包封率和载药量的影响,优选PTX-PBCA-NPs的制备工艺.方法 以包封率和载药量为主要评价指标,分别采用界面缩聚法和乳化聚合法制备PTX-PBCA-NPs,进行对比研究.用正交设计优选处方.结果 界面缩聚法、乳化聚合法制备的PTX-PBCA-NPs的包封率范围均在94.39%～9.23%(n=3)之间,界面缩聚法制备的PIX-PBCA-NP的载药量可达(1.07±0.03)%(n=3),而乳化聚合法制备的PTX-PBCA-NP的载药量可达(0.86:±0.01)%(n=3).用正交试验优选出最佳工艺条件,PTX-PBCA-NPs载药量为0.80%,包封率为95.71%,粒径为235.6nm.结论 两种制备方法制备出来的PTX-PBCA-NPs的包封率符合药典要求.经比较研究,界面缩聚法可能是提高PTX-PBCA-NPs载药量较好的一种制备方法(P<0.05). 【期刊名称】《南方医科大学学报》 【年(卷),期】2010(030)004 【总页数】5页(P763-766,770)

【关键词】紫杉醇;聚氟基丙烯酸正丁酯;纳米粒;界面缩聚;乳化聚合 【作 者】陈如大;任非;李国锋;刘思佳

【作者单位】南方医科大学南方医院药学部,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院药学部,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院药学部,广东,广州,510515;南方医科大学南方医院药学部,广东,广州,510515

【正文语种】中 文 【中图分类】R944

紫杉醇（PTX，商品名Taxol）目前已成为肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤等常见恶性肿瘤的一线用药［1］，是近年国际市场上最热门的抗癌药物。由于其水溶性差，临床上使用的助溶剂为聚氧乙烯蓖麻油/无水乙醇（50∶50）制成的无色黏稠状浓溶液，由此极易导致严重的过敏反应以及肾毒性和神经毒性等不良反应［2］。为增加PTX的溶解度，降低毒副作用，采用靶向给药和控缓释技术来改善PTX的给药方式和疗效是目前研究的热点［3］。选择以聚氰基丙烯酸正丁酯（PBCA）为载备PTX纳米粒，在国内尚未见文献报道，国外研究报道也不多。其次PBCA纳米粒是目前唯一被认为有可能对肿瘤多药耐药（MDR）逆转有效的纳米粒载体［4］，这进一步突显了进行该研究的现实意义。Amitava［5］采用乳化聚合法制备PTXPBCA-NP，但缺乏对其载药量的考察，只有对包封率与粒径大小的研究报告。Huang等［6］微乳法制备，虽然与传统乳化聚合法比较，其载药量与包封率均提高了，但载药量仍然较低，难以满足临床的治疗要求。因此，我们试图通过改进的界面缩聚法和乳化聚合法制备纳米粒，以粒径、包封率和载药量为主要指标，全面考察纳米粒的质量，进行比较研究，而后利用正交设计确定最佳制备工艺，以期能最大程度地提高PTXPBCA-NP的载药量，得到理想的PTX-PBCA-NP，为进一步的逆转肿瘤多药耐药性的实验研究提供物质基础。 1 材料和仪器 1.1 试药与试剂

紫杉醇（纯度99.5%，西安天丰科技有限公司）；氰基丙烯酸正丁酯（BCA，北京瞬康医用胶有限公司，批号：080305）；右旋糖酐-70（美国Sigma

Chemical Co.）；大豆卵磷脂（上海伯奥生物科技有限公司）；乙腈（HPLC级，Burdick&Jackson公司）；三油酸甘油酯（化学纯，广东光华化学厂有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。 1.2 仪器

Malvern-3000Hs光子相关光谱仪（英国Malvern公司）；奥立龙CHNO060型PH计 （美国Thermo-Orion公司）；HJ-6多头磁力加热搅拌器（金坛市富华电器有限公司）；台式离心机TGL-16B(上海优浦科学仪器有限公司)；TMP电子天平（德国Satorius公司）；SHC-C型循环水式多用真空泵 （巩义市英峪予华仪器厂）；Waters高效液相色谱仪 （Waters515泵与Waters2487紫外检测器，美国Waters公司）。 2 方法与结果

2.1 PTX-PBCA-NP 的制备

2.1.1 界面缩聚法制备 称取100 mg右旋糖酐和100 mg大豆卵磷脂，加入10 ml蒸馏水，超声溶解，用稀盐酸（0.1 mol/L）调pH为3.0，制成水相。将16.5 mg紫杉醇用1 ml丙酮溶解，再加入0.1 mlBCA和0.05 ml三油酸甘油酯，搅拌混匀，然后再加入一定量丙酮，使得总体积为5 ml，混匀，形成有机相。然后在室温、搅拌（600 r/min）条件下，用注射器将有机相逐滴滴加到水相中，持续搅拌4 h后，用NaOH（0.1 mol/L）调pH为7.0，继续搅拌30 min，减压抽滤后用0.45 μm滤膜过滤，最终得到乳白色的混悬液。实验步骤相同，将丙酮换为无水乙醇，进行同样的制备以期优选工艺。

2.1.2 乳化聚合法制备PTX-PBCA-NP称取100 mg右旋糖酐和100 mg大豆卵磷脂，加入10 ml蒸馏水，超声溶解，然后用稀盐酸（0.1 mol/L）调pH为3.0，加入紫杉醇溶液，然后在室温、搅拌下（600 r/min），滴加入0.1 mlBCA（加入一定量丙酮稀释，稀释比例为1∶4），搅拌 4 h，然后用 NaOH（0.1 mol/L）调

pH 为 7.0，继续搅拌30 min，减压抽滤后用0.45μm滤膜过滤，得到乳白色的混悬液。实验步骤相同，将丙酮换为无水乙醇，进行同样的制备以期优选工艺。 2.2 PTX-PBCA-NP中PTX含量测定方法的建立

2.2.1 分析方法建立 色谱柱为反相KromasilC18柱（5μm，150 mm×4.6 mm），流动相为乙腈 -水（50/50，v/v），流速为 1.0 ml/min，进样量为 20 μl，检测波长为227 nm，柱温为常温。在该色谱条件下，PTX峰在保留时间约为9.7 min时可完全分离，见图1。

图1 HPLC图谱Fig.1 HPLC ChromatogramsA:Blank B:Sample;C:Standard sample

2.2.2 标准曲线的制备 精密称量1.0 mg紫杉醇，加甲醇溶解，定容至 10 ml，得到 100μg/ml的 PTX标准 液 。 分 别 量 取 0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 ml，分别加入甲醇，定容至 10 ml，取 20 μl进样（n=8），以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程 Y=51772X-9178.1，R2=0.9998。表明 PTX 在（0.05～100μg/ml）浓度内峰面积与浓度呈良好的线性关系。 2.3 PTX-PBCA-NP的质量评价指标

2.3.1 粒径和多分散系数的测定 用Malvern-3000HS光子相关光谱仪测定PTX-PBCA-NP的粒径及其多分散系数，吸取10μl相应样品，而后用去离子水稀释200～300倍。所选测量参数：激光光源为633.0 nm，测试的温度为

（25.00±0.05）℃，经样品散射后的光是在90°范围内变化不同的角度来测定的，光信号256通道、高速数字相关器进行处理。测试的结果分别给出体均粒径（dv）、数均粒径（dn）和多分散度（Q）及粒径的多分散系数（PI）。

2.3.2 包封率的测定 取载药的胶体溶液0.5 ml，用甲醇定容至25 ml，超声、离心，取上清液20μl进样，测得胶体溶液中总PTX浓度为C1。另取胶体溶液样品，摇匀，取0.5 ml载药胶体溶液，置3 000超滤离心管中，离心后取超滤液 100μl，

加入400μl甲醇，混匀、离心，取上清液20μl进样，测得胶体溶液中游离PTX浓度为C2。色谱条件同\"2.3.1\"。按公式包封率=（Wa-Ws）/Wa×100%=（1-C2/10C1）×100%计算包封率。其中，Wa为PTX的投药量，Ws为游离的PTX的量。2.3.3载药量的测定 取载药的胶体溶液于离心管中，低速离心，尽可能沉淀未被包封的紫杉醇结晶聚集体。然后取上清液在40℃下真空干燥，得到PTXPBCA-NP干粉，称质量5 mg，用甲醇溶解，定容至25 ml，超声、离心后取上清液20μl进样，测得纳米粒内的PTX浓度为C3。色谱条件同\"2.3.1\"。按公式载药量=W包/×100%=(C3/2)%。 其中，W包为包裹在NP内PTX的量，为制得的NP的量。

2.4 比较PTX-PBCA-NP的制备方法

2.4.1 粒径和多分散系数对比 根据方法\"2.1.1\"和\"2.1.2\"制备PTX-PBCA-NP，并按方法\"2.3.1\"测定PTX-PBCA-NP的粒径和多分散系数。界面缩聚法制备的PTX-PBCA-NP的粒径、多分散系数分别是（224.5±5.7）nm、（0.27±0.10）； 乳化聚合法 制备 的PTX-PBCA-NP的粒径、多分散系数分别是 （245.2±5.3）nm、（0.60±0.08）。

2.4.2 载药量和包封率对比 按照方法\"2.1.1\"和\"2.1.2\"制备PTX-PBCA-NP，并按方法\"2.3.2\"和\"2.3.3\"测定PTX-PBCA-NP的包封率和载药量。根据不同条件，两种不同制法的PTX-PBCA-NP的包封率范围在94.39%～99.23%之间，均大于90%，符合2005年版药典二部附录规定要求。两种方法制备PTX-PBCA-NP的载药量比较，结果见表1。采用SPSS13.0软件进行两样本t检验，结果表明用乙醇取代丙酮作为有机溶剂，采用两种方法制备出来的PTX-PBCA-NP的载药量无显著性差异，其他条件制备出来的NPs的载药量均有显著性差异（P＜0.05）。可以看出界面缩聚法优于乳化聚合法，其制备的载药量最高可达 （1.07±0.03）%。 表1 PTX-PBCA-NP的载药量Tab.1 Mean drug loading efficiency of PTX-

PBCA-NP(%,n=3,Mean±SD)Organic solvent Amountof Dextran-70(mg) pH ofaqueous phase Acetonum Alcohol 100 200 300 3.0 4.0 5.0 Interfacial 1.07±0.03 0.44±0.09 1.07±0.03 0.33±0.02 0.41±0.03 1.07±0.03 0.60±0.03 0.19±0.02 Emulsion 0.61±0.05 0.52±0.05 0.61±0.05 0.45±0.01 0.31±0.01 0.61±0.05 0.28±0.01 0.86±0.01 2.5 PTX-PBCA-NP制备处方正交实验

最终确定采用界面缩聚法制备PTX-PBCA-NP。在单因素考察基础上，筛选影响纳米粒包封率和载药量的5个主要因素，每个因素选择4个水平，按L16(45)正交表设计实验。其因素水平及试验结果见表2。比较极差（R）值大小可以看出不同因素在实验中所起的作用不同。R值越大，说明此因素对所考察指标的影响越大。极差分析中，BCA体积浓度对PTX-PBCA-NP平均粒径的影响最大。同样，其对载药量的影响最大，Dextran 70质量浓度对载药量的影响最小；而水相pH值对包封率的影响最大，大豆卵磷脂质量浓度对包封率的影响最小。综合正交实验结果的极差分析和方差分析，对于纳米给药系统，纳米粒的粒径小﹑包封率高和载药量大是关键指标，影响实验结果的各因素主次顺序为D＞E＞C＞B＞A，故选取最佳工艺为A1B3C3D3E3，即Dextran 70质量浓度为80 mg（w/v），大豆卵磷脂质量浓度为 120 mg（w/v），PTX质量浓度为22 mg（w/v）及BCA体积浓度为0.12 ml（v/v），水相 pH 为 4.0。 2.6 最佳处方和工艺验证实验

按最佳处方和工艺条件制备PTX-PBCA-NP共3批，NP 平均粒径为

（226.93±11.95）nm，粒径多分散系 数范 围 为 0.26～0.34， 平均 包 封 率 为 （95.72±0.08）%，平均载药量为（0.8±0.07）%。其中一个批号的样品，用Malvern-3000HS光子相关光谱仪测定PTXPBCA-NP的粒径分布。

表2 正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal experimentsNO. Factors Z-

Average/nm DL/% EE/%A/mg B/mg C/mg D/ml E 1 80 80 11.0 0.08 2.0 339.1 0.44 99.94 2 80 100 16.5 0.10 3.0 303.8 0.21 94.81 3 80 120 22.0 0.12 4.0 235.6 0.80 95.71 4 80 140 33.0 0.14 5.0 204.3 0.24 95.38 5 100 80 16.5 0.12 5.0 276.5 0.62 81.03 6 100 100 11.0 0.14 4.0 269.0 0.38 96.38 7 100 120 33.0 0.08 3.0 228.9 0.22 97.61 8 100 140 22.0 0.10 2.0 321.0 0.25 96.04 16 140 140 11.0 0.12 3.0 428.2 0.30 97.59 15 140 120 16.5 0.14 2.0 217.7 0.27 98.08 14 140 100 22.0 0.08 5.0 188.1 0.37 95. 13 140 80 33.0 0.10 4.0 180.4 0.30 96.18 12 120 140 16.5 0.08 4.0 182.5 0.35 97.06 11 120 120 11.0 0.10 5.0 190.4 0.23 90.22 10 120 100 33.0 0.12 2.0 321.0 0.44 97.07 9 120 80 22.0 0.14 3.0 229.5 0.26 97.23 3 讨论 3.1 纳米载体

以聚氰基丙烯酸正丁酯（PBCA）为载体，其最大的优点在于聚合过程简单，所生成的聚合物在生物体内可降解，对人体组织基本无毒性。根据文献报道显示，其产物为水溶性的聚氰基丙烯酸和乙醇，另外少部分降解为甲醛和氰基乙酸酯，虽然体外实验显示该纳米粒能产生一定的毒性，但纳米粒在体内条件下产生的毒性会更低［7］。20 世纪 70 年代后期，Couvreur等［8］已使用PBCA制备载药纳米粒，由于可生物降解及其在外科临床应用中的安全性而成为应用较早也较成熟且具有前景的纳米材料。本项目研究小组在前期也进行了一些探讨，用丝裂霉素C为模药，制备了粒径小、包封率和载药量高、质量稳定的PBCA纳米粒［9］。经过近30年的发展，证实PBCA-NP较其他纳米载体有较好的稳定性，经表面修饰后可制成主动靶向和物理化学靶向制剂。而且证实PACA-NP是目前少数可通过血脑屏障 （BBB）的纳米粒之一，空白的PACA-NP甚至还可以与药物起协同作用，另外PACA-NP是目前唯一被认为有可能对多药耐药逆转有效的纳米粒载体［4］。

3.2 PTX-PBCA-NP制备方法

目前，国内外有大量关于聚氰基丙烯酸烷酯纳米制剂的文献报道，而多数以乳化聚合法包封水溶性药物或吸附脂溶性药物，所得纳米粒为骨架型的纳米球。而界面缩聚法适用脂溶性药物的制备。本文作者通过与乳化聚合法比较，研究探讨了界面缩聚法，即氰基丙烯酸烷酯在有机溶剂与水的界面发生聚合，包封水难溶性药物，该方法简单易行，能为聚氰基丙烯酸烷酯类聚合物制备纳米粒提供新的视野。通常情况下，用界面缩聚法所得的载药量和包封率比乳化聚合法高。本研究的试验结果也证实了这一结论。

纳米粒的质量考察指标主要包括有载药量、包封率和粒径［10］，载药量可直接影响临床用药剂量，而包封率则体现了制备工艺的优劣及制剂质量。因此，在评价纳米粒质量时，除了考察制剂的包封率，更重要是要考察载药量指标，从而更为全面地评价纳米粒制剂质量。

目前检索到的有关PTX-PBCA-NPs制备的文献多没有提供载药量数据，仅有一篇文献报道的数据也非常低 ［（0.56%±0.04）%］， 难以满足临床的治疗要求。而载药量可直接知道临床用药剂量，一般以越高越好，可使服药量减少。表1数据表明，本研究采用界面缩聚法制备，得到的载药量最高可达 （1.07±0.03）%，比采用微乳法制备的高。

本实验中相同的组成，方法不同造成载药量不同，而且界面缩聚法优于乳化聚合法，可能是由于方法不同，紫杉醇分散在不同的介质中，造成浓度不同，影响了它的构象与分子间相互作用。先前的研究表明，紫杉醇具有络合结构，它的溶液构象与分子间的相互作用都可能依赖于溶剂的种类和其在有机溶剂内的浓度［11］。 Balasubramanian 等［11］曾报道过，当紫杉醇浓度由10-3 mol/L稀释到10-4 mol/L时，紫杉醇的构象与分子间相互作用就会发生改变。还有，界面缩聚法中，聚合物BCA与紫杉醇共同溶解于有机溶剂中，两者之间先发生相互作用，然后再

在油/水界面上发生聚合。因此，导致纳米粒的载药量高于乳化聚合法。 3.3 制备PTX-PBCA-NP的影响因素

传统的界面缩聚法是将脂溶性药物与BCA单体溶于无水乙醇中制成有机相，而在本实验中采用丙酮代替无水乙醇作为油相溶剂，能缩小粒径分布范围。选择丙酮作为油相溶剂时，观察到油相溶剂非常澄清，而选择乙醇作为油相溶剂时，油相产生了大量浑浊。可能是无水乙醇提供阴离子C2H5O-，从而在油相中诱发了部分聚合反应的发生，形成了纳米球。当油相缓慢加入到水相时，部分没发生聚合的BCA单体在油/水两相之间发生聚合反应，形成载药纳米球。而选择质子惰性溶剂丙酮作为油相溶剂时，由于它无法提供阴离子，不能引发BCA的聚合反应，因此观察到的现象是BCA加到油相溶剂时溶液非常澄清，说明BCA在丙酮中较乙醇中稳定。

纳米粒包封率的测定方法最常用的有：葡聚糖凝胶色谱法、透析法、低温超速离心法和超滤离心法。透析法虽然操作简单，但所需时间较长；葡聚糖凝胶色谱法的预处理操作繁琐；超速离心法测定包封率，通常是测定离心后的上清液中游离的药物含量，再通过总药量减去游离药物含量得包裹在纳米粒中的药量［12］。本实验中，采用超速离心法无法将载药纳米粒与游离PTX分离开，最后选择超滤离心法分离游离PTX药物，然后用HPLC法测定。选用的超滤膜截留相对分子质量是3000，而包药后的纳米粒相对分子质量大于3000［5］，采用超滤法可将相对分子量为853.9的PTX与包药的纳米粒分离开来，从而得到游离PTX，这样就可测定出包封率与载药量。选用甲醇作为溶剂溶解载药纳米粒，既可有效将纳米粒的囊壁破坏，使PTX全部释放出来，还能将释放出来的PTX完全溶解。

毫微粒是一种新型的药物载体。本实验经比较研究，确定采用界面缩聚法制备PTX-PBCA-NP。但其载药量与紫杉醇其他种类的纳米制剂相比仍较低，故制备工艺仍需进一步改进。还有，PTX-PBCA-NP能否提高疗效，降低毒性，需通过进一

步实验进行验证。 参考文献：

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