前 言
咖啡因(Caffeine)又名咖啡碱，属甲基黄嘌呤化合物，化学名称为1,3,7-三甲
基黄嘌呤，具有提神醒脑等刺激中枢神经作用，但易上瘾。为此，各国制定了咖啡
因在饮料中的食品卫生标准，美国、加拿大、阿根延、日本、菲律宾规定饮料中
咖啡因的含量不得超过200mg/L，南斯拉夫规定不得超过120mg/L，我国到目前为
止咖啡因仅允许加入到可乐型饮料其含量不得超过150mg/kg，为了加强食品卫生
监督管理，建立咖啡因的标准测定方法十分必要。
紫外分光光度法和HPLC法是可乐型饮料，咖啡和茶叶以及制成品中咖啡因含量
的测定方法。简单、快速、准确。最低检出浓度:紫外法对可乐型饮料为3mg/L；对
咖啡、茶叶及其固品为5mg/100g；对咖啡和茶叶的液品为5mg/L。 *PLC法
对可乐型饮料为0.72mg/L；对茶叶、咖啡及其制品为1.8mg/100g。
本标准的附录A为提示的附录。
本标准由卫生部卫生监督司提出。
本标准由上海市食品卫生监督检验所、上海卫生检疫局负责起草。
本标准主要起草人:第一篇:何倩琼、郑理、方有宗、李绍良
第二篇:李绍良、庄慎谦、毛显林、何倩琼
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
中华人民共和国国家标准
饮料中咖啡因的测定方法 GB/T 16344
Method for determination of Caffeine in Beverages
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1 范围
本标准规定了可乐型饮料、咖啡、 茶叶及其制成品中咖啡因含量的测定方
法—紫外分光光谱法和高效液相色谱法(HPLC)。
本标准适用于可乐型饮料、咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因的测定。
第一篇 紫外分光光谱法
2 原理
咖啡因的三氯甲烷溶液在276.5nm波长下有最大吸收， 其吸收值的大小与
咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。
3 试剂
本标准所用试剂均为分析纯试剂，实验用水为蒸馏水。
3.1 无水硫酸钠
3.2 三氯甲烷 使用前重新蒸馏
3.3 1.5(m/v)高锰酸钾溶液:称取1.5g高锰酸钾，用水溶解并稀释至100mL。
3.4 亚硫酸钠和硫氰酸钾混合溶液:称取10g无水亚硫酸钠(Na2SO3)。 用水溶解并
稀释至100mL。另取10g硫氰酸钾，用水溶解并稀释至100mL，然后二者均匀混合。
3.5 15%(V/V)磷酸溶液:吸取15mL磷酸置于100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
3.6 20%(m/V)氢氧化钠溶液:称取20g氢氧化钠，用水溶解，冷却后稀释至100mL。
3.7 20%(m/V)醋酸锌溶液:称取20g醋酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]加入3mL冰乙
酸， 加水
溶解并稀释至100mL。
3.8 10%(m/V)亚铁溶液:称取10g亚铁[K4Fe(CN)6·3H2O]用水溶解并稀释
至100mL。
3.9 咖啡因标准品:含量98.0%以上。
3.10 咖啡因标准储备液:根据咖啡因标准品的含量用重蒸三氯甲烷配制成每mL相当
于0.5mg咖啡因的溶液，置于冰箱中保存。
4 仪器
紫外分光光度计。
5 分析步骤
5.1 样品的处理
5.1.1 可乐型饮料:在250mL的分液漏斗中，准确移入10.0mL经超声脱气后的
均匀可乐型饮料试样，加入1.5%高锰酸钾溶液5mL，摇匀，静置于5min，加入混合
溶液10mL，摇匀，加入30mL重蒸三氯甲烷。振摇100镒，静止分层，收集三氯甲
烷。水层再加入10mL重蒸三氯甲烷，振摇100次，静置分层。合并二次三氯甲烷
萃取液， 并用重蒸三氯甲烷定容至100mL，摇匀，备用。
5.1.2 咖啡、茶叶及其固成品:在100mL烧杯中称取经粉碎成低于30目的均匀
样品0.5～2.0g，加入80mL沸水，加盖，摇匀，浸泡2h，然后将浸出液全部移入
100mL容量瓶中，加入20%醋酸锌溶液2mL，加入10%亚铁溶液2mL，摇匀，
用水定容至100mL，摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液5.0～20.0mL按5.1.1操作进行，
制备成100mL三氯甲烷溶液， 备用。
5.1.3 咖啡或茶叶的液成品，在100mL容量瓶中准确移入10.0～20.0mL均匀
样品，加入20%醋酸锌溶液2mL，摇匀，加入10%亚铁溶液2mL，摇匀，
用水定容至100mL，摇匀，静置沉淀，过滤。取滤液5.0～20.0mL按5.1.1操作进
行，制备成100mL三氯甲烷溶液，备用。
5.2 标准曲线的绘制
从0.5mg/mL的咖啡因标准储备液中，用重蒸三氯甲烷配制成浓度分别为
0、5、10、15、20μg/mL的标准系列，以0μg/mL作参比管，调节零点，用1cm比
色杯于276.5nm下测量吸光度，作吸光度-咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归
方程。
5.3 样品的测定
在25mL具塞试管中，加入5g无水硫酸钠，倒入20mL样品的三氯甲烷制
备液，摇匀，静置。将澄清的三氯甲烷用1cm比色杯于276.5nm测出其吸光度，
根据标准曲线( 直线回归方程)求出样品的吸光度相当于咖啡因的浓度C(μg/mL)。
同时用重蒸三氯甲烷作试剂空白。
6 结果
6.1 计算
(C-C0)×100 1000
可乐型饮料中咖啡因含量(mg/L)=-----------------------------×
-------------- .......................（1）
V 1000
咖啡、茶叶及其固成品中咖啡因含量(mg/100g)
(C-C0)×100×100×100
= -------------------------------------------------..............（2）
V1×M×1000
咖啡、茶叶及其固成品中咖啡因含量(mg/100g)
(C-C0)×100×100×1000
=--------------------------------------------------..............（3）
V1×V×1000
式中:C—样品吸光度相当于咖啡因浓度(μg/mL)
C0—试剂空白吸光度相当于咖啡加浓度(μg/mL)
m—称取样品的重量(g)
V —移取样品的体积(mL)
V1—移取样品处理后水溶液的体积(mL)
6.2 在本实验条件下
本法仪器检出限为0.2μg/mL，方法检出限可乐型饮料为3mg/L，咖啡、
茶叶及其固成品为5mg/100g，咖啡或茶叶的液品为5mg/L。
标准曲线线性范围:0.0～30.0μg/mL。
相关系数:0.999。
方法回归率:90.1～101.8%。
相对标准偏差:4.0%。
6.3 允许差 同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值可乐型饮料
为10%，咖啡、茶叶及其制品为15%。
第二篇 高效液相色谱法(HPLC)
7 原理
咖啡因的甲醇液在286nm波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度
成正比，从而可进行定量。
8 试剂
8.1 甲醇 HPLC试剂
8.2 乙腈 HPLC试剂
8.3 三氯甲烷 分析纯(必要时须重蒸)
8.4 超纯水(18.2兆欧)
8.5 无水硫酸钠 分析酏
8.6 氯化钠 分析纯
8.7 咖啡因标准品 纯度98%以上
9 仪器和设备
9.1 液相色谱
9.2 色谱柱BondapakmC18(30cm×3.9mmid)
9.3 预柱 RESAVETM C18
9.4 超声清洗器(CQ250)
9.5 混纤微孔滤膜
10 分析步骤
10.1 样品的处理
10.1.1 可乐型饮料
10.1.1.1 脱气:样品用超声清洗器在40℃下超声5min。
10.1.1.2 过滤:取脱气试样10.0mL通过混纤微孔滤膜过滤，弃去最初的5mL，保留
后5mL备用。
10.1.2 咖啡、茶叶及其制成品: 3F取2g已经粉碎且小于30目的均匀样品或液体样
品放入150mL烧杯中，先加2～3mL超纯水，再加50mL三氯甲烷，摇匀，在超声处
理机上萃取1min(30Sec二次)，静置30min，分层。将萃取液倾入另一160mL烧杯。
在样品中再加50mL三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤，弃去样品，合并二次萃
取液，加入少无水硫酸钠和5mL饱和氧化钠，过滤，滤入100mL容量瓶中，用三
氯甲烷定容至100mL。 最后取10mL滤液按10.1.1.2操作进行。
10.2 色谱条件
10.2.1 流动相 甲醇:乙腈:水=57:29:14(每升流动相中加入0.8mol/L乙酸液50mL)。
10.2.2 流动相的流速 1.5mL/min
10.2.3 进样重 可乐型饮料10μL，茶叶咖啡及其制成品5～20μL。
10.3 标准曲线的绘制
用甲醇配制成咖啡因浓度分别为0、20、50、100、150μg/mL的标准系列，
然后分别进样10μL于入286nm测量峰面积，作峰面积一咖啡因浓度的标准曲线或
求出直测回归方程。
10.4 样品测定
从试样中吸取可乐饮料10μL或咖啡、茶叶及其制品5mL进样， 于286nm
处测其峰面积，然后根据标准曲线(或直线回归方程)得出样品的峰面积相当于咖
啡因的浓度C(μg/mL)。同时作试剂空白。
11 结果
11.1 计算
可乐型饮料中咖啡因含量(mg/L)=C
咖啡、茶叶及其制成品中咖啡因含量(mg/100g)=10C F
式中，F----为进样量是5μL的倍数。
11.2 在本实验条件下
本法仪器检出限为0.72μg/mL，方法检出限:可乐型饮料为0.72mg/L,咖啡、
茶叶及其制品为1.8mg/100g。
标准曲线线性范围 0.0～150.0μg/mL
相关系数:0.999
方法回收率:91.9～105.8%
相对标准偏差:<2%
11.3 允许差:同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值可乐型饮料
为5%，咖啡、茶叶及其制品为10%。