牛病毒性腹泻病毒通用型RT-PCR检测方法的建立

农业大学学报２０１２，３５（３）：２１７￣２２Ｉ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　文章编号：１００７—８６１４（２０１２）０３—０２１７—０５　牛病毒性腹泻病毒通用型ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建立　郭春娟　。，吴星　星　，王璐　。，季新成。，冉多良　，　买买提・黑牙斯丁　，王克栋　，熊　浩　（１．农业大学动物医学学院，乌鲁木齐摘８３００５２；２．出人境检验检疫局，乌鲁木齐８３００６３）　要：　为建立～种快速、特异、简便的检测牛病毒粘膜腹泻病病毒Ｉ、Ⅱ型抗原的通用ＲＴ—ＰＣＲ方法，根据　ＧｅｎＢａｎｋ上已发表的牛病毒性粘膜腹泻病毒（ＢＶＤＶ）Ｉ、Ⅱ型５’端非编码区保守序列设计合成了两条引物，其中　上游引物为兼并引物。应用一步法ＲＴ—ＰＣＲ技术分别对Ｉ（Ｏｒｅｇｏｎ　Ｃ２４Ｖ）、ＩＩ型（２７９）标准株进行扩增，将ＰＣＲ产　物胶回收后连与ｐＭＤ１８一Ｔ载体，经ＰＣＲ、酶切鉴定条带均正确（２８８　ｂｐ），测序结果与预期一致。同时设牛疱疹病　毒Ｉ型、牛传染性鼻气管炎、猪瘟病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、ＭＤＢＫ细胞作对照，结果均为阴性；并对各地　州的样品进行检测。优化反应条件后，检测其灵敏度为１０～ＴＣＩＤ　。／ｍＬ。经对４００份临床样品检测，阳性检出率　为ｌＯ．７５　，明显高于ＥＬＩＳＡ检测。试验表明，该方法具有特异、灵敏、高效、快速、重复性好等特点，可用于牛病毒　粘膜腹泻病的临床检测及流行病学检测。　关键词：　牛黏膜腹泻病毒；５，｜ＵＴＲ；一步法ＲＴ—ＰＣＲ；检测　中图分类号：￥８５１．６５９．６　文献标识码：Ａ　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｆｏｒ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｖｉｒｕｓ　Ｄｉａｒｒｈｅａ　ＧＵＯ　Ｃｈｕｎ－ｊｕａｎ　，ＷＵ　Ｘｉｎｇ—ｘｉｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｌｕ　，ＪＩ　Ｘｉｎ—ｃｈｅｎｇ　，　ＲＡＮ　Ｄｕｏ—ｌｉａｎｇ　，Ｍａｉｍａｉｔｉ　Ｈｅｉｙａｓｉｄｉｎｇ　，ＷＡＮＧ　Ｋｅ—ｄｏｎｇ　，ＸＩＯＮＧ　Ｈａｏ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００５２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｘｉｎ　ｊｆａｎｇ　Ｅｎｔｒｙ—Ｅｘｉｔ　Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ　Ｂｕｒｅａｕ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００６　３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｒａｐｉｄ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｉｍｐｌｅ　ｃｏｍｍｏｎ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｂｏｖｉｎｅ　ｖｉｒａｌ　ｄｉａｒｒｈｅａ／　ｍｏｃｏｓａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　Ｉ，Ⅱａｎｔｉｇｅｎ，ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｂｙ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｖｉｒａｌ　Ｄｉａｒ—　ｒｈｅａ／Ｍｕｃｏｓａ　Ｂｉｒｕｓ（ＢＶＤＶ）Ｉ，１Ｉ　ｔｙｐｅ　５’Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ　Ｒｅｉｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｏｎ　Ｇｅｎ—　Ｂａｎｋ：ｏｎｅ　ｏｆ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ａｎ　ｕｐｓｔｒｅａｍ　ａｎｄ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒ．Ｉ（Ｏｒｅｇｏｎ　Ｃ２４Ｖ），Ｉ／ｔｙｐｅ（２７９）ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｂｙ　ｏｎｅ—ｓｔｅｐ　ＲＴ—ＰＣＲ。ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｇｅｌ　ｗｅｒｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ　ｅｖｅｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐＭＤ１　８一Ｔ　ｂｙ　ＰＣＲ，ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｂａｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｒｒｅｃｔ　ａｓ　２８８　ｂｐ．ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎ　ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎｓ．Ａｌｓｏ　ｌｏｃａｔｅｄ　ｂｏｖｉｎｅ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　Ｉ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｒｈｉｎｏｔｒａ—　ｃｈｅｉｔｉｓ，ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｓｗｉｎｅ　ｆｅｖｅｒ　ｖｉｒｕｓ，Ｂｌｕｅ　ｔｏｎｇｕｅ　ｖｉｒｕｓ，Ｆｏｏｔ　ａｎｄ　ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ。ＭＤＢＫ　ｃｅｉｌｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ；ａｎｄ　ａｌｓｏ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐａｒｔｓ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ．　Ｗｈｅｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ，ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ａｓ　１０　ＴＣＩＤ　５０／ｍＬ．Ｉｎ　ａ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　４００　ｓａｍｐｌｅｓ　ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＢＶＤ　ｄｉｓｅａｓｅ，ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　ａｂｏｕｔ　１０．７５　，ｉｔ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ＥＬｌＳＡ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ＲＴ—ＰＣＲ　ｗａｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢＶＤＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　ｂｏｖｉｎｅ　ｖｉｒｕｓ　ｄｉａｒｒｈｅａ／ｍｕｃｏｓａｌ；５’一ＵＴＲ；ｏｎｅ—ｓｔｅｐ　ＲＴ—ＰＣＲ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　收稿日期：２０１２～０１—１８　基金项目：维吾尔自治区高技术研究项目（２０１０１０１０１）　通讯作者：冉多良，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｊｒｄｌ７＠１６３．ｃｏｒｎ　２１８　农业大学学报　２０１２年　牛病毒性腹泻病毒（Ｂｏｖｉｎｅ　ｖｉｒａｌ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉ—　ｒｕｓ，ＢＶＤＶ）属于黄病毒科、瘟病毒属，主要引起牛　病毒性腹泻＿１］。ＢＶＤＶ根据其基因组５’非翻译区　（５’。ｕＴＲ）序列的差异，可将ＢＶＤＶ分为两种基因　型，即基因Ｉ型（ＢＶＤＶＩ）和基因Ⅱ型（ＢＶＤＶＩＩ）。　ＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣ；扩增的目的片段长度为　２８８　ｂｐ。用Ｂｌａｓｔ软件进行核苷酸同源性分析，并验　证序列的特异性。引物由鼎国有限公司合成。　１．４病毒增殖　将长成单层的ＭＤＢＫ细胞弃去原培养液，用适　量的ＰＢＳ液冲洗，分别接种ＮＡＤＬ、２７９标准株的　种毒及各地州采的样品（全血及精液反复冻融２次　后用加双抗的ＭＥＭ进行１：５稀释，血清　１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ，将二者分别用　其中，ＢＶＤＶ工已被国内外广泛地研究报道，它包括　许多经典株和多种常见的疫苗株，所引起的症状常　常为一过性发热、下痢和急慢性粘膜病；ＢＶＤＶⅡ引　起的急性感染常表现为发烧、腹泻、血小板减少症、　出血、呼吸失调和高流产率、高死亡率　Ｊ。因　ＢＶＤＶ可引起动物的持续性感染，许多持续感染动　物处于免疫耐受状态［３］，在体内不产生抗体；而病毒　分离技术、血清学方法和免疫化学技术存在检测灵　敏度不高或费时费力等缺点。任敏等通过设计针对　ＢＶＤＶ的公用性引物来检测ＢＶＤＶｌ４］。鉴于未知　样品的不可知性，需要在最短的时间内检测其感染　与否，ＲＴ—ＰＣＲ方法检测仍然是目前首选方法。本　实验根据ＧｅｎＢａｎｋ上发表的ＢＶＤＶ基因组序列，　通过比对其型之间及与猪瘟序列的差异，在以前的　基础上设计出了一条兼并型的上游引物能同时检测　出该两种型，建立了一种可以同时检测该两型的　ＲＴ—ＰＣＲ方法，该方法主要可用于实验室检测及　ＢＶＤＶ流行病学的检测。　１材料与方法　１．１　毒株、细胞、临床样品和相关对照样品　ＢＶＤＶ标准毒株Ｉ型Ｏｒｅｇｏｎ　Ｃ２４Ｖ、ＭＤＢＫ细　胞由本实验室保存、ＢＶＤＶ　ＩＩ型２７９株由美国俄亥　俄州大学张彦教授馈赠；牛抗凝全血、精液和流产胎　儿组织等样品采自不同牛场；牛传染性鼻气管　炎、猪瘟病毒、蓝舌病病毒等病原阳性核酸由出　入境检验检疫局技术中心实验室保存。　１．２　主要试剂　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶（５　Ｕ／ｔ￣Ｌ）、Ｍ—ＭＬＶ反转录　酶、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｄＮＴＰ、ＤＬ２０００　ＤＮＡ　Ｍａｋｅｒ、ｐＭＤ１　８一　Ｔ载体、性内切酶ＥｃｏＲ工等购自宝生物工程　（大连）有限公司，琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒、高　纯质粒小量制备试剂盒购自百泰克生物技术（北京）　有限公司，Ｔｒｉｚｏｌ、ＭＥＭ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，马血清购　自Ｇｉｂｉｃｏ公司，其他试剂均为分析纯。　１．３引物的设计与合成　根据已知的牛黏膜腹泻病病毒５　ＵＴＲ区特　异性片段应用Ｐｒｉｍｅｒ　ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０软件各设计一对　特异性引物，５’一ＵＴＲ～Ｆ：ＡＴＧＣＣＣＷＴＡＧＴＡＧ—　ＧＡＣＴＡＧＣＡ（Ｗ—Ａ／Ｔ），５’一ＵＴＲ—Ｒ：ＴＣＡＡＣＴＣ—　０．４５　ｍｏｌ／Ｌ￣滤膜过滤）约５００　Ｌ吸附２　ｈ，弃掉　瓶内液体，加入适量维持液培养，间隔２４　ｈ观察　１次。待约有７５　以上的细胞发生病变时将其进行　收毒。另设不接病毒的细胞作为对照。　１．５　样品处理及模板ＲＮＡ的制备　按照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的Ｔｒｉｚｏｌ快速提取试剂说　明书进行操作。　１．６　一步法ＲＴ—ＰＣＲ反应体系及扩增条件的优化　采用２５　Ｌ反应体系：ｄＮＴＰ终浓度分别为　１．５，２．０，２．５和３．０　ｍｍｏｌ／Ｌ，引物终浓度分别为　０．２，０．３，０．４和０．５　ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ，Ｍｇ抖终浓度分别为　１．０，１．５，２．０，２．５和３．０　ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合　酶分别为０．７５，１．Ｏ０，１．２５，１．５０　Ｕ，Ｍ—ＭＬＶ反转　录酶终浓度分别为３０，４０，５Ｏ　Ｕ，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ的终浓度　为２Ｏ，３０，４Ｏ　Ｕ，退火温度为６３℃，循环数分别为　３０，３５，４Ｏ，４５。优化一项时其他参数不变。收集　ＰＣＲ产物用１．０　的琼脂糖凝胶电泳观察结果。　１．７　ＰＣＲ扩增产物的克隆和鉴定　将目的基因用琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒纯　化，与ｐＭＤ１８一Ｔ载体连接，转化至Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５　ｏ：感　受态细胞中。用高纯质粒小量制备试剂盒提取重组　质粒ＤＮＡ，经ＥｃｏＲ　Ｉ、Ｉ－ＢｎｄⅢ双酶切和ＰＣＲ电　泳鉴定后，筛选出含有正确插入片段的重组克隆质　粒送华大基因公司进行测序。　１．８特异性实验　分别对牛疱疹病毒Ｉ型、牛传染性鼻气管炎、猪　瘟病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒核酸，采用优化后　的最佳反应条件进行ＰＣＲ扩增。每次扩增反应同　时设ＭＤＢＫ细胞作阴性对照和ＢＶＤＶ工、Ⅱ型核酸　作阳性对照，以检测方法的特异性。　１．９重复性试验　用优化好的ＰＣＲ方法进行３次重复检测，以验　证其稳定性。　１．１０灵敏度试验　取经ＭＤＢＫ细胞增殖的细胞毒，测定其　ＴＣＩＤ　。值。将病毒进行１０倍倍比稀释，分别取稀　第３期　郭春娟，等：牛病毒性腹泻病毒通用型ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立　２２１　参考文献：　［１］　殷震，刘景华．动物病毒学［Ｍ］．２版．北京：科学出版　社，１９９７．　［２］　Ｒｉｄｐａｔｈ　Ｊ　Ｆ，Ｂｏｌｉｎ　Ｓ　Ｒ，Ｄｕｂｏｖｉ　Ｅ　Ｊ．Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏ—　ｖｉｎｅ　ｖｉｒａｌ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ　ｉｎｔｏ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，　１９９４，２０５（１）：６６—７４．　［３］　Ｒａｄｏｓｔｉｓｔ　Ｏ　Ｍ，Ｌｉｔｌｅｊｏｌｈｎｓ　Ｉ　Ｒ．Ｎｅｗ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　Ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｖｉｒａｌ　Ｄｉａｒｒｈｅａ　Ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｃａｎ　Ｖｅｔ　Ｊ．，１９８８，２９：５１３－５２８．　［４］　任敏，朱国强．基因２型牛病毒性腹泻病毒ＲＴ—ＰＣＲ检　测方法的建立和初步应用［Ｊ］．中国预防兽医学报，　２００８（９）：６６５—６６８．　［５］　Ｂｒｏｗｎｌｉｅ　Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｔｔｌｅ　ｉｎ　ｅａｒｌｙ　Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ　ｗｉｔｈ　ａ　ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　ｂｏｖｉｎｅ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｒｅｓ　ｉｎ　ｖｅｔ　ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，４６：３０７～３１１．　ｒ６］　Ｂｅｎｄｆｅｌｄｔ　Ｓ，Ｇｒｕｍｍｅｒ　Ｂ，Ｇｒｅｉｓｅｒ－Ｗｉｌｋｅ　Ｉ．Ｎｏ　Ｃａｓｐａｓｅ　Ａｃｔｉｃａｔｉｏｎ　ｂｕｔ　０ｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｃｌ一２　ｉｎ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｃｅｌｌｓ　Ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｎｏｎｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｖｉｒｕｓ　Ｄｉａｒｒｈｅａ　Ｖｉ—　ｒｕｓ［Ｊ］．Ｖｅｔ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ，２００３，９６（４）：３１３－３１６．　［７］崔保安，朱沙，陈圣先．牛病毒性腹泻病毒蛋白特性的　研究进展［Ｊ］．中国畜牧兽医，２００３，３０（２）：３２—３４．　［８］宋永峰，张志，张燕霞，等．猪源牛病毒性腹泻病毒的流　行初探［Ｊ］．中国动物检疫，２００８，２５（７）：２５—２７．　［９］Ｘｕ　Ｘ，Ｚｈａｎｇ　Ｑ，Ｙｕ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒａ—　ｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓ　ｉｓ　ｏｆ　ａ　ｐｉｇ　ｂｏｖｉｎｅ　ｖｉｒａｌ　ｄｉａｒｒｈｅａ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅ—　ｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ，２００６，１２２（１－２）：１６４—１７０．　［１Ｏ］张宁，秦建华，赵国伟，等．牛病毒性腹泻一粘膜病诊断　方法的研究进展［Ｊ］．动物医学进展，２００８，２９（２）：９３—　９７．　［１１］　张会敏，王恩峰，郑明学，等．牛病毒性腹泻的流行情　况及防制［Ｊ］．中国畜牧兽医，２００９，３６（１１）：１２０—１２２．