抗体的研究进展
摘要： 单克隆抗体的问世使得人们对于一种新的治疗疾病的药物充满期待，然而鼠源性抗体往往会受到人体免疫系统的排斥，因而抗体的人源化已成为治疗性抗体的发展趋势。用人抗体取代鼠抗体，是克服鼠单抗临床应用障碍的关键。随着分子生物学研究的深入和一些技术的突破，抗体人源化技术日益成熟。大量人源化抗体已经被广泛应用于临床试验和应用。本文主要介绍了目前人源化抗体构建的三种方法：嵌合、重构和表面重塑，并对人源化抗体的未来发展趋势进行了展望。
关键字：基因工程 抗体 人源化 1 基因工程抗体简介
基因工程抗体(genetically engineered antibodies ， GEAb)是按人工设计所重新组装的新型抗体分子，它既保留或增加了天然抗体的特异性和生物学活性，又去除或减少了无关结构，降低或基本消除抗体的免疫原性，使抗体人源化，并改善抗体的药物动力学，具有生产简单， 价格低廉，容易获得稀有抗体的优点，具有广阔的临床应用前景。其主要技术原理是：首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中，并在适当的宿主细胞(如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞及昆虫细胞等)中表达并折叠成有功能的抗体分子，筛选出高表达细胞株，再用亲和层折等手段纯化抗体片段[1]。 1984年，Morrison等首次报道人鼠嵌合抗体在骨髓瘤成功表达，标志着基因工程抗体的诞生。1986年，Jones等人源化抗体构建和表达成功。1988年，Skerra等第一次证明抗体的Fab和Fv片段可以在大肠杆菌(E。coli)中正确地装配成保持原抗体特异性的小分子抗体。19年，Huse等用外分泌型载体构建成功小鼠抗体库，利用抗体库技术获得了全人源化的抗体。1994年，德国基因工程抗体研究小组成功地将基因工程抗体在培养细胞中表达，抗体释放到组织培养液中，获得了较高的抗体产量[2]。
抗体药物的最大特征在于它识别抗原的高度专一性。本文主要介绍人源化抗体的发展历程与研究进展。近几年来随着鼠单抗人源化技术越来越成熟大量的人源性单抗被用于临床治疗肿瘤研究 ，并取得一定进展 ，由于其具有高效、低毒、病人不易产生抗药性等优点 ，同时又克服鼠单抗半衰期短 、反复应用会引进病人的等缺点，人源性单抗已成为继手术切除、放疗及化疗后又一治疗肿瘤的药物[3]。
2 人源化抗体的发展
早在一个世纪前，Paul Ehrlich就把抗体形容为“魔弹”，1975年杂交瘤技术建立以后，大量制备含有相同抗原决定簇的单克隆抗体成为可能，从而使“魔弹”进入了临床试验阶段[4]。1982年，当Philip Karr将第一株抗独特型单抗(anti-1d)应用于B细胞淋巴瘤的临床治疗并取得成功之后[5]，治疗性抗体的研究很快成为
生物医药的热点，许多以单克隆抗体为研究对象的公司相继成立。然而，随着单克隆抗体研究的广泛深入开展，大量临床实验结果背离了人们的期望。直到1994年，只有一株用于治疗急性移植排斥反应的单克隆抗体OKT3被FDA批准上市。此时，人们对于治疗性单抗研究的热情已经开始消退，转而冷静地思考和分析单抗应用中存在的问题：一是抗体的鼠源性，鼠杂交瘤分泌的单抗不仅受到人体免疫系统的排斥，而且其Fc段不能有效地激活人体效应系统；此外就是单抗的生产成本高，用药难度大。
尽管人们十分清楚，用人抗体取代鼠抗体，是克服鼠单抗临床应用障碍的关键，然而反复实验证明，杂交瘤技术不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。80年代末期，随着分子生物学研究的深入，在抗体基因工程研究领域相继出现了一些技术突破，如用PCR方法扩增抗体可变区基因、大肠杆菌表达功能性抗体片段以及噬菌体展示抗体功能片段等，这些技术为抗体人源化和人抗体的研究奠定了基础。在疾病治疗中，人源化抗体之所以优于鼠抗体，不仅因为抗体中鼠源成分的减少降低了机体的免疫排斥反应，还在于人抗体中的Fc段能够诱发机体的效应功能-募集效应因子或效应细胞，后者对靶细胞具有杀伤作用。人抗体的另一大优点是它在体内的半衰期长，鼠抗的半衰期不到20h，而人源化抗体可达数天甚至有时接近21d。对于该现象的解释是：人源化抗体中的Fc段可以特异结合人血管内皮细胞上的Fc受体(FcRn)，使抗体内化到血管内皮细胞而不被降解，并能够回到血液中参与循环。鼠抗体由于不能有效的与人FcRn结合而很快从循环系统中清除。
1988 年Riechmann 首次成功地构建了有活性的人源化抗体[6] ，他们首先按照Kabat 法查出大鼠YTH34。5HL 抗体CDRs 所在部位及序列，然后通过六个含有大鼠抗体CDRs序列的寡聚核苷酸将其插到人抗体(New 和REI) 重链或轻链的V 区框架中，构建成整形的重链和轻链V 区结构域( HuV HCAMP) ，然后分三步与C区结构域相联：第一步把整形的重链结构与大鼠IgG2b 的C 区相联，并转染H 链丢失突变的YTH34。5 杂交瘤细胞中，比较HuV HCAMP，HuV H2CAMP 及大鼠IgG2b 的活性，发现HuVHCAMP 活性降低；第二步把大鼠重链V 区分别与人抗体IgG1，2，3，4C 区相译，转染H 链丢失的YTH34。5细胞，证明只有与IgGl 相联的抗体有活性，故选择IgGl 做为框架区；第三步把整形的重链与人抗体C 区结构域相联；最后把重新构建的重链与轻链两个克隆转染不分泌Ig的同一鼠骨髓瘤细胞YO中，结果成功的分泌出能与CAMPATH-l 抗原结合的抗体。
在构建人源化抗体时要特别注意两个问题：一是要选择同源性较好的人抗体V 区做为框架区；另一问题是要对鼠抗体互补决定区(Complementarity determining regin， CDRs) 附近的氨基酸残基进行分析，查出CDRs 空间构型有影响的氨基酸残基，在构建人源化抗体时把这些氨基酸残基与CDRs 一起插入到框架区中，否则将会影响人源化抗体的活性。还应注意到被选做为框架区的人抗体V 区中也常出现特殊的氨基酸残基，它既不同于人抗体V 区的保守序
列，也不同于将要人源化抗体的序列，在这种情况下，为保证人源化抗体的活性，应把这些部位的氨基酸残基换成鼠抗体相应位置的氨基酸残基。 3人源化抗体的构建方法
至今构建人源化单抗使用的方法主要有嵌合、重构和表面重塑[7]。 3.1 嵌合抗体
嵌合抗体就是将非人源抗体可变区移植到人抗体恒定区，仍保留了原来鼠源抗体约30%左右的鼠源序列，其免疫原性虽有所降低，但仍可引起不同程度的人抗鼠抗体(Human anti-mouse antibody， HAMA)应答。为了降低在嵌合抗体中鼠源部分，只移植鼠CDRs，而不移植整个抗体可变区，所构建的“嵌合”抗体随后就成为了研究热点[8]。Roberto等认为抗体CDR 区中仅有部分与抗原相接触的氨基酸残基，决定该抗体的特异性，这被称之为特异性决定残基( Specificity-Determining Residues， SDRs) ， Roberto等在构建嵌合抗体时，仅仅移植CDRs区内这些必需的SDRs到人抗体框架区，成功地改造了一个抗癌胚抗原的鼠源单抗COL-1，显著地降低了其免疫原性，临床显示了很好的治疗效果。 无论CDRs或SDRs移植所构建的“嵌合”抗体与其亲本非人源单抗相比，其抗原的亲和力都有一定程度的降低，因为亲本非人源单抗框架区的某些氨基酸位点参与了抗原结合或者对维持抗原结合区构象具有重要作用。同时在对大量的嵌合抗体研究中发现有时其生物学效应并不一定完全与预期设想相符。 3.2抗体改型技术（Antibody Reshaping）的应用
每一抗体分子Fab段的轻、重链可变区具有6个抗原互补决定区(CDR) 。CDR1、CDR2 和CDR3之间有一个起结构稳定作用的框架区( FR) ，即以FR分隔而起支架作用，共同形成CDR平面可直接接触抗原，决定抗体的特异性， FR 只是作为支持CDR的支架，而且其立体构象极为保守。改型抗体就是移植非人源抗体的CDR 到人抗体骨架区( Framework region， FR) ，同时维持与亲本非人源抗体相似的CDR 构象构建而成的人源化抗体。相对于亲本非人源抗体和嵌合抗体，改型抗体仅有9%来源于亲本非人源的单抗，经临床试验证明，其改型抗体的免疫原性得到显著降低。
在抗体改型试验中，为了使改型抗体与其亲本鼠单抗和抗原相结合的特异性及亲和力尽可能一致，就必需保证改型抗体与其亲本抗体有相似的抗原互补决定区立体构象。众多实验证明，在FR区某些关键位点上保持原有的氨基酸残基对抗原互补决定区构象至关重要，通常这些位点应被同时移植到人抗体FR。如果仅仅移植CDRs至人抗体FR而忽视这些关键位点上的氨基酸残基，其抗原互补决定区的构象会将发生较大的改变。然而， CDR构象的微小改变均可能导致抗原亲和力降低。多数情况下，仅仅移植CDRs到人抗体FR上产生的改型抗体将丧失全部或大部分抗原亲和力，只有同时再移植某些关键位点的氨基酸残基(通常该位点的氨基酸残基维持着高变区的构象)后才能保持改型抗体的抗原亲和力。所以，如何识别这些影响CDRs构象的框架区氨基酸残基位点就显得尤为重要，尽管Foote and Winter定义了单抗框架区关键氨基酸位点的“游标”区(Vermier
zone)，亲本鼠单抗的这些位点氨基酸残基应当保留在人源化抗体中，但是一般来说还是要通过更多的经验分析或计算机模拟分析，并进一步的实验验证才能更准确的定位这些关键氨基酸位点，并将其保留在改型抗体中，以维持改型抗体与抗原的亲和力。
3.3抗体表面重塑技术( Antibody resurfacing) 的应用
1991年Padlan提出了利用表面重塑的方法来改造非人源抗体，此方法的原则就是将非人源单抗可变区( Fv)表面非人源的基酸残基替换为人源性的氨基酸残基，使非人源抗体Fv区的表面人源化，降低其免疫原性，同时不影响Fv区的整体空间构象，从而保留其抗原结合部位的结构。这个方法的程序是首先模拟抗原结合区构象，然后识别框架区非人源的氨基酸残基，最后将非人源的氨基酸残基人源化。表面重塑抗体应用于人体时是否会引起免疫应答，迄今尚未见有临床报道。表面重塑技术优于移植重构技术，在设计人源化抗体时更简单一些，因为该技术仅需改变表面残基即可，而保留了大量内核的非人源残基。所以重塑抗体中抗原结合区构象及相对位置与原有抗体更为接近。另一方面，重构抗体在用于人体感染、自身免疫疾病、Neoplastic疾病治疗时表明，仍有微弱的免疫原性，而重塑抗体目前仍未见有临床实际应用的报道。表面重塑技术的基本理论依据是，暴露于表面的氨基酸残基在免疫原性方面起重要作用。然而与重构抗体相比，重塑抗体中含有大量的非人源残基， 考虑到抗原提呈过程，可能会导致更大的异源免疫排斥反应的发生。 4 前景与展望
在近年美国FDA批准的新药中，已有100多种人源化单抗进行了临床试验， 其中数十种抗体相关新药得到了应用[9]。
计算机与生物技术的发展日臻成熟，使其应用于抗体人源化改造成为可能，指导抗体改型和抗体的表面重塑，取得了很好的效果。通过对抗原-抗体相互作用的模拟，对抗体分子微观构象与一级序列之间关系的推测，减少了抗体人源化过程中的盲目性。噬菌体抗体库、核糖体展示文库等技术的出现，使不经免疫则可获得任何一种动物(包括人)的特异性抗体成为可能。针对不同的异源抗体， 选择合适的人源化途径来构建更适合于临床应用的人源化抗体，将为新药的开发和一些顽固疾病的治疗开辟新的路径[10]。 参考文献
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[4] 林芸,阎锡蕴. 人源化抗体研究历程及发展趋势[J].生物工程学报,2004,20(1) [5] Miller RA.Treatment of B-cell lymphoma with monoclonal anti-idio-type antibody[J].New Engl J Med,1982,306(9)
[6] Riechmann Letal . Reshaping human antibodies for therapy[J ] . Nature ,1988 [7] 吴永强,董关木. 人源化单克隆抗体研究进展[J].微生物学免疫学进
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