[文章编号]1000鄄2200(2020)05鄄0569鄄04
569
·基础医学·
LncRNA鄄ROR抑制结直肠癌细胞转移的作用研究
胡世丰1,雷摇春2,施摇炜1,查摇诚1
[摘要]目的:了解LncRNA鄄ROR在结直肠癌细胞转移中的作用。方法:在前期工作中,已经发现LncRNA鄄ROR在结直肠癌组织中低表达,并抑制肠癌细胞的增殖。进一步,我们采用Transwell功能研究LncRNA鄄ROR的过表达对结直肠癌细胞SW620迁移的影响;并采用划痕实验探索LncRNA鄄ROR过表达后结直肠癌细胞SW620伤痕愈合的变化。结果:SW620细胞在ROR过表达后,穿过人工膜的细胞数减少(P<0.01);在迁移和侵袭实验中,与对照组比较,SW620LncRNA鄄ROR穿过Transwell膜的细胞数减少(P<0.01),侵袭能力减弱(P<0.01);划痕实验中,划痕48h后LncRNA鄄ROR的细胞间间距大于对照组(P<0.01)。结论:LncRNA鄄ROR抑制结直肠癌细胞的转移。[关键词]结直肠肿瘤;LncRNA鄄ROR;SW620细胞;转移
[中图法分类号]R735.3摇摇摇[文献标志码]A摇摇摇DOI:10.138/j.cnki.issn.1000鄄2200.2020.05.003
StudyontheinhibitionofLncRNA鄄RORcellsoncolorectalcancermetastasis
TonglingAnhui244061;2.DepartmentofGeneralSurgery,TonglingPeople忆sHospital,TonglingAnhui244000,China)
[Abstract]Objective:ToinvestigatetheroleofLncRNA鄄RORcellsinmetastasisofcolorectalcancer.Methods:ThelowexpressionofLncRNA鄄RORincolorectalcancerwasidentified,whichcouldinhibittheproliferationofcolorectalcancercells.TheeffectsoftheoverexpressionofLncRNA鄄RORoncolorectalcancerSW620cellsmetastasiswereexploredusingTranswellassay.Theroleofthethemigrationandinvasionexperiments,comparedwiththecontrolgroup,thenumberofcellswithSW620LncRNA鄄RORpassingtheTranswellmembranedecreased(P<0.01),andtheinvasionabilitydecreased(P<0.01).Inthewoundhedingassay,theintercellularinhibitthemetastasisofcolorectalcancercells.
[Keywords]colorectalneoplasms;LncRNA鄄ROR;SW620cells;metastasis
overexpressionofLncRNA鄄RORonthehealingofSW620cells忆scratchwasinvestigatedusingthewoundhealingassay.Results:AfterLncRNA鄄RORwasoverexpressedinSW620cells,thenumberofcellspassingthroughtheartificialmembranedecreased(P<0.01).In
(1.DepartmentofMedicine,TonglingVocationalandTechnicalCollege,
HUShi鄄feng1,LEIChun2,SHIWei1,ZHACheng1
spacingofLncRNA鄄RORafter48hofscratchingwasgreaterthanthatincontrolgroup(P<0.01).Conclusions:LncRNA鄄RORcan
摇摇结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,随着国人生活习惯的改变,结直肠癌的发病率呈逐年增高趋势[1-3]。目前,结直肠癌的治疗以手术为主,辅以化疗、放疗、免疫治疗等综合治疗,尽管取得很好的效果,仍然有相当一部分病人出现转移。临床上亟需了解结直肠癌转移的分子机制,以期提高早期诊断率和病人的生存率
[4-6]
中,LncRNA在多层面尤其在转录方面影响细胞的正常功能,引起细胞的增殖、转移、分化异常[9]。LncRNA在癌基因的方面发挥重要作用,其表达的失控可引起肿瘤的增殖、侵袭、凋亡异常[10]。LOEWER等[11]在2010年报道了一种能调程的LncRNA,并将这该RNA命名为LncRNA鄄ROR(regulatorofreprogramming,ROR),以下简称为ROR。ROR不仅能细胞的重编程过程,其在多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡中发挥重要作用并与病人预后密切相关[12-13]。但是LncRNA鄄ROR在结直肠癌转移中的作用尚欠充分研究。在前期发表的研究中,我们发现ROR在癌组织中的表达相比于癌旁组织有明显降低,临床病理资料显示ROR的表达与病人的TNM分期有关,qRT鄄PCR检测证实SW620中的ROR表达增加,其高表达导致SW620增殖能力的下降。为了进一步了解ROR在节已经分化的细胞转换为多能诱导干细胞重编程过
LncRNA)是一类长度>200个核苷酸的非编码RNA
[7]
长链非编码RNA(longchainnoncodingRNA,。研究
[8]
。
表明,LncRNA在表观遗传、转录、
转录后等多个层面基因的表达。在肿瘤发生
[收稿日期]2019-08-28摇[修回日期]2019-11-22
[基金项目]安徽省高校自然科学研究重点项目(KJ2017A635);安[作者单位]1.铜陵职业技术学院医学系,安徽铜陵244061;2.安[作者简介]胡世丰(1979-),男,硕士,讲师.
徽省铜陵市人民医院普外科,244000
徽省质量工程高水平教学团队项目(2018jxtd122)
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结直肠癌中的作用,我们采用侵袭、迁移、划痕实验研究ROR在结直肠癌细胞迁移中的作用。现作报道。
1摇材料与方法
JBengbuMedColl,May2020,Vol.45,No.5
中培养。48h用PBS缓冲液漂洗细胞3次,去除漂起1.5摇统计学方法摇采用t检验。2摇结果
来的细胞,加入无血清培养液。倒置显微镜下拍照。
1.1摇细胞培养及转染、计数摇结直肠癌细胞SW620用含10%FBS的10培养基,置于5%CO2、37益培养箱中常规传代培养,选对数生长期的24h后换液,qRT鄄PCR检测转染效果,获得稳转细胞株后行后续实验。稳转细胞SW620/Vector、SW620/37益培养箱中常规传代培养。用无血清培养液把细胞悬浮并稀释至10mL左右,取1mL的细胞悬液加入1mL的0.4%的台盼蓝染液。混匀后滴入血1.2摇迁移实验摇取对数生长期的细胞,吸去培养液500滋L含10%血清的培养液,上室加入200滋L细胞悬液。置入37益、5%CO2培养箱中培养。48h后,用镊子取出小室,吸去上室中培养液,用棉棒擦0.1%结晶紫染液固定、染色30min。PBS液漂洗两1.3摇侵袭实验摇取对数生长期的细胞无血清培养次后在倒置显微镜下观察、拍照、计数。
拭小室的上室内面后将上室放入用甲醇配置的将细胞浓度调整成1伊105/mL,在小室的下室加入球计数板上,计数。
细胞,将合成的含ROR的慢病毒滴入培养液中,
2.1摇ROR导致结直肠癌细胞的迁移及侵袭能力降低摇SW620细胞在ROR过表达后,穿过人工膜的细胞数减少(P<0.01);Transwell侵袭实验结果表明过表达ROR后,结直肠癌细胞的侵袭能力减弱(P<0.01)(见表1、图1)。
表1摇2组结直肠癌细胞的迁移及侵袭能力比较(x依s)
分组SW620/VectorSW620/ROR
tP
n3——3
迁移细胞数151.33依10.1552.00依8.32
13.11<0.01
侵袭细胞数134.33依11.5349.67依7.29
10.75<0.01
ROR用含10%FBS的10培养基,置于5%CO2、
后无血清培养液饥饿处理8h。用胰酶消化细胞后,
液饥饿处理8h。Matrigel胶放到4益冰箱中过夜,在冰上将无血清培养液与Matrigel胶按5颐1比例混合,取24孔板,每孔加入50滋L稀释后的Matrigel胶,37益培养箱重放置30min。将细胞浓度调整成的培养液,上室加入200滋L细胞悬液。置入37益、擦拭小室的上室内面后将上室放入用甲醇配置的在倒置显微镜下观察、拍照、计数。
2.2摇ROR抑制结直肠癌细胞的划痕愈合摇在同样的初始划痕距离下,经过48h的培养后,相比于空载体对照组,ROR过表达SW620细胞间间距较大(P<0.01)(见表2、图2)。
摇表2摇划痕实验时和48h后2组SW620细胞间间距比较
(x依s)
分组SW620鄄VectorSW620鄄ROR
tP
n3——3
0h细胞间距30.03依1.2229.23依1.56
0.97>0.05
48h细胞间距4.20依1.079.67依1.72
4.68<0.01
1伊105/mL,在小室的下室加入500滋L含10%血清
5%CO2培养箱中培养。48h后,用镊子取出小室,0.1%结晶紫染液固定、染色30min。PBS液漂洗后1.4摇划痕实验摇取对数生长期结直肠癌细胞,PBS缓冲液漂洗两次后,胰酶消化,吸去胰酶后用含10%血清的培养液悬浮细胞,将悬浮细胞按5伊105/孔接种于6孔板中,对照组和实验组均设3个复孔。次日将细胞换液,20滋L的黄头及尺子进行高于蒸汽灭菌处理。待细胞长满时用黄头进行划痕,用PBS缓冲液漂洗细胞3次洗去划下的细胞,加入无血清培养液。拍照后置于37益、5%CO2培养箱
3摇讨论
摇摇高通量测序技术证明人类基因组有约98%为
Copyright©博看网 www.bookan.com.cn. All Rights Reserved.蚌埠医学院学报2020年5月第45卷第5期非编码基因,LncRNA占其中的80%[14]。LncRNA究表明LncRNA在多个肿瘤中发挥重要作用。SUN等[15]发现MEG3胃癌的增殖和凋亡,在胃癌中提示预后不良的指标。LIU等[16]发现lncRNA鄄LET在肺癌中通过抑制EMT和Wnt/茁鄄catenin抑制肺癌的进展。在非小细胞肺癌中,SNHG1表达增高,在非小细胞肺癌中干扰SNHG1表达后细胞增殖受抑制[17]。ROR是新近发现的参与肿瘤发生、发展多个过程的LncRNA。FAN等[18]研究发现ROR通过阻碍组蛋白G9A甲基转移酶、促进组蛋白H3K9甲基化的释放,从而激活TESC启动子。沉默ROR后,通过G9A甲基转移酶介导的H3K9甲基化引起的TESC启动子的表达被抑制,进而显著抑制肿瘤细胞增殖和转移。进一步研究表明,在不沉默ROR的情况下,沉默TESC启动子引起肿瘤增殖、转移方面类似的现象。从而证实,ROR作为一个诱饵RNA通过抑制组蛋白修饰酶的结合促进肿瘤的发生发展。ZHAN等
[19]
571
的下室,除了穿过小室的孔隙,还需要穿过Matregel胶,结合迁移实验,可以更加完整的模拟肿瘤体内转移途径。我们的研究发现ROR过表达的SW620细胞不论在迁移还是在侵袭实验中,均表现出较低的迁移、侵袭能力。细胞划痕是模拟细胞爬行愈合能力的一个重要实验,通过对贴壁细胞划痕后观察细胞爬行愈合能力来评估细胞的转移能力。我们在划痕实验中发现,ROR过表达的SW620细胞及对照组细胞在初始划痕时间距无明显差异,经过48h的培养液后,SW620/ROR组细胞的间距明显宽于对照组,说明ROR的过表达导致SW620细胞的爬行愈合能力下降。综上所述,SW620细胞中过表达ROR导致SW620细胞的迁移、侵袭、划痕愈合能力下降,表明ROR的过表达可导致结直肠SW620细胞转移能力下降,ROR作为潜在的抑癌基因,其作用机制值得进一步研究。
[
参
考
文
献
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[20]
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的增殖、转移、凋亡、耐药均有关。我们的前期研究已经发现,结直肠癌中ROR的表达明显低于周围正常组织,其表达与病人的TNM分期有关,但关于ROR在结直肠癌转移中的作用尚缺乏深入的研究。
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(本文编辑摇刘梦楠)
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