不同培养体系可逆改变人类胚胎干细胞的分化倾向

中国组织工程研究与临床康复　掰　７４誊第’４０』努２０１０—１０—０１出版　ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｖｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｏｃｔｏｂｅｒ　７。２０１０　ＶｏＬ１４，Ｎｏ．４０　＠　不同培养体系可逆改变人类胚胎干细胞的分化倾向术士　罗树伟，林戈，孙争，谢平原，卢光璜　Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎｃｌｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｌｕｏ　Ｓｈｕ・ｗｅｉ，Ｌｉｎ　Ｇｅ，Ｓｕｎ　Ｚｈｅｎｇ，Ｘｉｅ　Ｐｉｎｇ—ｙｕａｎ，Ｌｕ　Ｇｕａｎｇ—ｘｉｕ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　ＢＡＣＫＧＲ０ＵＮＤ：Ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｍ　ｅｃｅｌｌｓ（ｈＥＳＣｓ）ｃａｎ　ｂｅ　ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ　ｉｎ　ｆｅｅｄｅｒ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａＩ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄ　ｈａｖｅ　ｔｈｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｔｏ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｉｎｔｏ　ｔｈｒｅｅ　ｇｅｒｍ　Ｊａｙｅｒｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｃｅｌｌｓ．　０ＢＪＥＣＴＩＶＥ：ＴＯ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉａＩｃ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　０ｎ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｈＥＳＣｓ．　ｌｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．ＣｅｎｔｒａＩ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．　Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００７　Ｈｕｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．　Ｃｈｉｎａ　ＭＥＴＨＯＤＳ：ｈＥＳＣｓ　ｉｎ　ｆｅｅｄｅｒ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｍｅ（ｐａｓｓａｇｅ　２７）ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｍ　ｅｆｏｒ　５６　ｐａｓｓａｇｅｓ　ａｎｄ　ｒｅｔｕｒｎｅｄ　ｂａｃｋ　ｔｏ　ｆｅｅｄｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ．ｈＥＳＣｓ　ｉｎ　ｔｈｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｆｅｅｄｅｒ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　７０　ｐａｓｓａｇｅｓ，ｃｈｅｍｉａＩｃ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｒｎ　ｆｏｒ　５６　ｐａｓｓａｇｅｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｈＥＳＣｓ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｆｒ０ｍ　ｃｈｅｍｉａｌｃ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｆｅｅｄｅｒ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　１　３　ｐａｓｓａｇｅｓ　ａｎｄ　２０　ｐａｓｓａｇｅｓ１　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｌｆｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｙ　ｒｆｏｒ　ＳＳＥＡ４．　Ｅｘｐｒｓｓｉｅｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｄｉｉｅｒｆｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｒｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｌａｙｅｒｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｆｏＩｌｏｗｉｎｇ　ｈＥＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｏ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｔｅｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．　ＲＥＳＵＬＴＳ　ＡＮＤ　ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：ｈＥＳＣｓ　ｅｘｈｉｂｉｔｄ　ｄｉｅｆｅｒｅｎｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｉｎｃｌｉｎａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｂｏｄｉｅｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｆｅｅｄｅｒ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａＩ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｍｓ．ａｎｄ　ｅｔｈｅ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎｃｌｉｎａｔｉｏｎｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｌｙ．１ｎ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ，ｈＥＳＣｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｎｔｉ—ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｎｅｕｒａｌ　ｅｃｔｏｄｅｒｍ　ｃｅｌｌｓ．ａｎｄ　ｔｈｉｓ　ａｎｔｉ．ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｃａｎ　ｂｅ　ｒｅｓｃｕｅｄ　ｗｈｅｎ　ｈＥＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｂａｃｋ　ｔｏ　ｆｅｅｄｅｒ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｎａｎｏｇ　ｍａｙ　ｈａｖｅ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｂｏｄｉｓ　ｄｉｅｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ．ＳＳＥＡ４　ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｈＥＳＣｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｐａｔｔｅｒｎ．Ｔｈｅｒｅ　ｍａｙ　ｂｅ　ｓｏｍｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ＳＳＥＡ４　ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎｄｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｆｅｅｄｅｒ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａＩ　Ｌｕｏ　Ｓｈｕ－ｗｅｉ☆．　Ｄｏｄｏｒ，ｌｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｔｅｍ　ＣｅｌＩｓ．ＣｅｎＶａＩ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｖ．　Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００７　Ｈｕｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，　Ｃｈｉｎａ　ｌｕｏｂｃｅｉｎｇ＠１２６　ｃｏｍ　Ｃｏ￣ｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　ｔｏ：　Ｌｕ　Ｇｕａｎｇ—ｘｉｕ．　ＤｏｃｔｏｒａＪ　ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ，　ｄｅｆｔｎｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｍｓ．ｅ　Ｌｕｏ　ＳＷ．Ｌｉｎ　Ｇ．Ｓｕｎ　Ｚ，Ｘｉｅ　ＰＹ，Ｌｕ　ＧＸ．Ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎｃｌｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ　ａｆｆｃｔｅｄ　ｂｙ　ｅｄｉｆｅｒｅｎｔ　Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，ｌｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｌｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．ＣｅｎｔｒａＩ　ＳＯｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．　Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００７．　Ｈｕｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．　Ｃｈｉｎａ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｍｓ．ｅＺｈｏｎｇｇｕｏ　Ｚｕｚｈｉ　Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ　Ｙａｎｊｉｕ　ｙｕ　Ｌｉｎｃｈｕａｎｇ　Ｋａｎｇｆｕ．２０１Ｏ：１４（４０）：７５１３－７５１８　【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｃｎ　ｈ￣ｐ：Ｕｅｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ】　摘要　背景：人类胚胎干细胞可以在饲养细胞依赖性培养体系和化学限定性培养体系下维持未分化状态，能够在体内外诱导分化　成三胚层来源的细胞类型。　目的：比较饲养细胞和化学限定性培养体系对人类胚胎干细胞特性的影响。　方法：将在饲养细胞培养体系下培养２７代的人类胚胎干细胞转入到化学限定性培养基体系中培养５６代，然后再将其转回　到饲养细胞培养体系中，将３种培养条件下的人类胚胎干细胞（饲养细胞培养体系培养７０代、化学限定性培养体系培养５６　代、化学限定性培养体系下培养７０代后转回饲养细胞培养体系下培养１３代和２０代）进行多能性分子标记ＳＳＥＡ４流式分　析等检测分析，同时对３种培养条件下人类胚胎干细胞经拟胚体诱导分化后分别检测多能性基因和三胚层分化基因的表达。　结果与结论：人类胚胎干细胞在饲养细胞和化学限定性培养体系下表现出不同的诱导分化倾向，在化学限定性培养体系下　表现出向神经诱导分化抑制，这种不同的诱导分化倾向可发生可逆性转换，当人类胚胎干细胞由化学限定性培养体系转回　到饲养细胞培养体系时，诱导分化倾向表现出与其在饲养细胞下诱导分化一致的模式。在拟胚体分化中，多能性基因Ｎａｎｏｇ　高可能对诱导分化倾向起着重要作用。与此同时。人类胚胎干细胞ＳＳＥＡ４细胞亚群发生相应的变化，人类胚胎干细胞在饲　养细胞和化学限定下培养体系下表现的分化倾向与人类胚胎干细胞亚群所占的比例存在关联　关键词：人类胚胎干细胞；培养体系：饲养细胞：诱导：分化　Ｉｇｘｄｉｒｅｃｔｏｒ＠ｙａｈｏｏ　ｃｏｍ　ｃｎ　Ｓｕｐｐｏｓｅｄ　ｂｙ：ｔｈｅ　ＮａＵｏｎａＩ　ＮａｔｕｒａＩ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆＣｈｉｎａ．Ｎｏ　ｏ２００６ＡＡ０２Ａ１０２　Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２０１０　－２３　Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２０１０－０７－０５　中南大学生殖与　干细胞研究所，湖　南沙市　４１０００７　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１６７３－８２２５．２０１０．４０．０２３　罗树伟，林戈，孙争，谢平原，卢光绣．不同培养体系可逆改变人类胚胎干细胞的分化倾向【Ｊ】．中国组织工程研究与临床康　复，２０１０，１４（４０）：７５１３－７５１８．　【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｏｒｇ　ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ】　罗树伟☆，男，　１９７５年生，湖南　省茶陵县人，汉　族，２００８年中南　大学生殖研究所　毕业，博士，主要　从事胚胎干细胞　研究。　ｌｕｏｂｏｓｉｎｇ＠１　２６．　供理想模型”。目前，ｈＥＳＣｓ所采用的培养体　系可以分为２类：饲养细胞依赖性培养体系和化　学限定性培养体系，饲养细胞容易分离培养　ｃｏｒｎ　通讯作者：卢光　绣，博士生导师，　教授，中南大学生　殖与干细胞研究　人类胚胎干细胞（ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ｈＥＳＣｓ）是来源于植入前囊胚内细胞团的　具有多向分化潜能的细胞，可以分化成为三胚　ｈＥＳＣｓ，但是具有劳动强度大等缺点　，而化　学限定性培养基具有成分确定，劳动强度小等　特点，但是分离培养ｈＥＳＣｓ系困难，目前采用　无饲养细胞培养体系分离培养ｈＥＳＣｓ报道较　Ｊ。所，湖南沙市　４１０００７　Ｉｇｘｄｉｒｃｔｅｏｒ＠　ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ　中图分类号：Ｒ３９４．２　文献标识码：Ｂ　文章编号：１６７３－８２２５　层来源的所有类型的细胞，同时因其具有无限　的体外扩增能力，可以为细胞替代治疗提供种　子细胞。ｈＥＳＣｓ在诱导分化过程中模拟了体内　饲养细胞培养体系和化学限定性培养体　（２０１０￣０－０７５１３－－０６　收稿日期：２０１０．０４．２３　修回日期：２０１０－０７－０５　系提供的微环境是存在差别，ｈＥＳＣｓ在饲养细　胚胎发育的过程，可以为研究人类胚胎发育提　｜ＳｓＮ　１６７３－８２２５　ｃＮ　２１—１５３彰Ｒ　ｃｏＤＥＮ：ＺＬＫＨＡＨ　胞培养体系下未分化状态维持，主要依赖饲养　（２０１００３０４０２１／Ｇ‘Ｑ）　７５１３　琴树俸．等　不网培券体系可逆改变久类珏瞻干细咆的分化顿向　细胞分泌的多种细胞因子，如碱性成纤维细胞生长因子　２（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＦＧＦ２）、Ｗｎｔ３ａ和　Ｇｒｅｍｉｎｉｎ等ｌ，一，而在化学限定性培养基中，ｈＥＳＣｓ未　Ｐ２７＋７０—２０）为实验材料进行细胞流式检测、多能性基因　和三胚层分化基因表达分析。　拟胚体多能性基因和三胚层分化基因表达检测：在拟胚　分化状态的维持主要是依靠加入外源性细胞因子，如　ＦＧＦ２、白血病抑制因子和Ａｃｔｉｖｉｎ、胰岛素样生长因子２　等　，ｈＥＳＣｓ在这两种培养体系下保持了胚胎干细胞　的基本特性一多能性特性，能够分化成三胚层来源的细　胞类型。目前，对饲养细胞培养体系下和化学限定性培　养体系对ｈＥＳＣｓ特性影响报道比较少见，本文主要分析　比较饲养细胞培养体系下和化学限定性培养体系下　ｈＥＳＣｓ分化特性上的差异。　１材料和方法　体培养的第１，４，７，１０，１３，１７天收集拟胚体团，抽　提ＲＮＡ，经ＤＮａｓｅ处理后，采用ＲｅｖｅｒｔＡｉＤ。　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ（＃Ｋ１　６２２，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）将　ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，分别检测多能性基因（Ｏｃｔ４，　Ｎａｎｏｇ和Ｒｅｘ１）和三胚层分化基因（外胚层基因Ｓｏｘ３，　Ｐａｘ６和Ｓｏｘｌ，中胚层基因Ｂｒａｃｈｙｕ￣，内胚层基因　Ｓｏｘｌ７，ＡＦＰ￥１］ＧＡＴＡ６）的表达情况。　多能性基因和三胚层分化基因引物序列及聚合酶链反应　扩增条件：　设计：细胞水平的体外观察实验。　时间及地点：于２００７－０１／２００８－１０在中南大学生殖　与干细胞研究所完成。　材料：本实验室自建系培养的ｈＥＳＣｓ系ＣｈｈＥＳ．８、　ＣｈｈＥＳ．１　８ｇＵＣｈｈＥＳ．２２１１８－１９］，建系所使用的人类囊胚都　已经与患者签署捐赠知情同意书。所使用的饲养细胞为　本实验室自行分离培养的人类胚胎成纤维细胞，培养基　和细胞因子均购自Ｇｉｂｃｏ公司。　方法：　细胞培养：本实验室自建ｈＥＳＣｓ细胞系ＣｈｈＥＳ一８，　ＣｈｈＥＳ一１　８和ＣｈｈＥＳ一２２　ｈＥＳＣｓ种植在Ｍｉｔ　Ｃ处理的人　类胚胎成纤维细胞来源的饲养细胞上，培养皿采用６孔　板，ｈＥＳＣｓ饲养细胞体系培养基为８５％ＤＭＥＭ／Ｆ１２，　１５％ＫＯ－ＳＲ，１％ＮＥＡＡ，Ｏ．１　ｍｍ０Ｉ，Ｌ　１３．ＭＥ，４　ｐｇ／Ｌ　ＦＧＦ２，每天换液１次，２　ｍＬ／次，每７　ｄ机械切割传代１　次，由于该饲养细胞体系采用人胚胎成纤维细胞作为饲　养细胞，简称为ＨＥＦ体系。将在ＨＥＦ体系下培养第２７　代的ｈＥＳＣｓ转入到化学限定性培养基中培养，ｈＥＳＣｓ　ｈＥＳＣｓ￣Ｂ胞表面标记物ＳＳＥＡ４流式分析：将ＨＥＦ体系下　和ＮＢ体系下未分化ｈＥＳＣｓ克隆采用ＣＤＢ消化５　ｍｉｎ，使　培养代数记录格式为Ｐ２７＋Ｘ（Ｘ为在化学限定性培养基　中培养的代数），ｈＥＳＣｓ化学限定性培养基为　ＤＭＥＭ，Ｆ１２，１　ｘＮ２，１　ｘＢ２７，０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ　３－ＭＥ，ＦＧＦ２　ｈＥＳＣｓ成单细胞，将４ｘｌ０ｓ个细胞以１　５００　ｒ／ｍｉｎ的速度　离一Ｌ，５　ｍｉｎ，去上清，加入２００　ｐＬ含有体积分数２０％山　羊血清的ＦＡＣＳ液体（９５　ｍＬ　１　ｇ／Ｌ叠氮化钠Ｈａｎｋ’Ｓ液中　加入５　ｍＬ进口胎牛血清），室温孵育３０　ｍｉｎ，ＦＡＣＳ液体　洗涤１次，１　５００　ｒ／ｍｉｎ的速度离心５　ｍｉｎ，去上清，加入　（４，４０，１００　ｐｇ／Ｌ），培养皿采用１孔板（进口胎牛血清室　温预处理４　ｈ，ＤＰＢＳ洗涤３次后使用），每天换液１次，　１　ｍＵ次，每６　ｄ机械切割传代１次，由于化学限定性培　养基中主要添加有Ｎ２￣Ｂ２７，所以简称为ＮＢ体系，同　时由于加入ＦＧＦ２浓度的不同，分别称为ＮＢ４、ＮＢ４０７￣　用ＦＡＣＳ液体按照１：５０稀释的一抗ＴＲＡ一１—６０或一抗　ＳＳＥＡ一４，室温孵育６０　ｍｉｎ，同时Ｉｓｏｔｙｐｅ为同型对照，　用ＦＡＣＳ液体洗涤２次，每次加入ＦＡＣＳ液体３　ｍＬ，加入　用ＦＡＣＳ液体按照１：４００稀释的ＦＩＴＣ标记的荧光二抗，　室温避光孵育６０　ｍｉｎ，用ＦＡＣＳ液体洗涤２次，每次加入　ＦＡＣＳ液体３　ｍＬ，加入４００　ｐＬ　ＦＡＣＳ液体，上机检测，　分析结果。　ＮＢ１００培养体系。ｈＥＳＣｓ拟胚体采用机械切割的方式将　饲养细胞培养体系和ＮＢ体系下ｈＥＳＣｓ克隆切割成小　块，在细菌培养皿中悬浮培养，所采用的拟胚体培养基　为不含ＦＧＦ２细胞因子ｈＥＳＣｓ饲养细胞体系培养基。将　ＨＥＦ体系下培养７０代ｈＥＳＣｓ、ＮＢ体系（ＮＢ４、ＮＢ４０￣　ＮＢ１ｏｏ）下培养５６代的ｈＥＳＣｓ（Ｐ２７＋５６）、ＮＢ体系培养后　转回ＨＥＦ体系培养１３代３１１２０代的ｈＥＳＣｓ（Ｐ２７＋７０．１３，　７５１４　主要观察指标：３种培养体系下ｈＥＳＣｓ中ＳＳＥＡ４阳　性细胞比率，以及３种培养条件下ｈＥＳＣｓ经拟胚体诱导　分化后多能性基因和ｊ＝胚层分化基因表达水平。　Ｐ　Ｏ．Ｂｏｘ　１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００４　ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ　雩树伟．等．不丽培葬体系可逆改变人类疑睡于镪魄的分化犊向　ＷＷＷ．ＣＲＴＥＲ．ｏｒｇ　设计、实施、评估者：设计、实施、评估均为本文作者。　２结果　２．２　ＮＢ培养体系下ｈＥＳＣｓ在拟胚体分化过程中基因　表达水平上表现抗分化　为了一步比较分析拟胚体之　间的差异，作者在基因表达水平上检测了多能性基因和　三胚层分化基因的表达情况。在多能性基因表达检测　中，Ｏｃｔ４￣１］Ｎａｎｏｇ在拟胚体持续培养的过程中存在表　２．１　ＮＢ培养体系下ｈＥＳＣｓ在拟胚体形态上表现可逆　抗分化　饲养细胞培养体系ＨＥＦ和ＮＢ培养体系下ｈＥＳ　Ｃｓ表现出典型的ｈＥＳＣｓ未分化特，怔Ｉ”，但是，在拟胚体　自发分化过程中，２种不同培养体系下ｈＥＳＣｓ存在显著　的差异，首先表现在拟胚体形态上，在ＨＥＦ培养体系下　达，其中在ＨＥＦ培养体系下ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体中，　Ｏｃｔ４的表达出现了一个逐渐降低的趋势，在第１７天的拟　胚体中表达最低，而在ＮＢ体系下ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体　中，Ｏｃｔ４依然持续维持高水平表达，Ｎａｎｏｇ的表达模式　类似Ｏｃｔ４表达，并且表达量变化更为明显。Ｒｅｘ１基因　在２种培养体系下ｈＥＳＣｓ来源拟胚体中的表达模式与　Ｎａｎｏｇ基因的表达模式相同。　ｈＥＳＣｓ（Ｐ７０）来源的拟胚体中，拟胚体生长速度慢，呈　现近圆形或圆形，而在ＮＢ体系下ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体　中，拟胚体生长速度较快，随着培养时间的延长，拟胚　体明显增大，呈现标准的圆形。随着ＥＢ培养时间的延长，　ＨＥＦ体系下的ｈＥＳＣｓ形成的拟胚体绝大多数出现囊腔，　而ＮＢ体系中，只有在ＮＢ４培养条件下ｈＥＳＣｓ（Ｐ２７＋５６）　在外胚层分化基因检测中，检测了不同培养体系下　ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体在不同时间点对早期神经发育关　键基因Ｓｏｘ３４￣１］Ｐａｘ６以及中晚期基因Ｓｏｘｌ的表达，结果　显示，在ＨＥＦ体系下ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体在第１天就存　在有较低水平表达Ｓｏｘ３基因，并且随着培养时间的延　续，Ｓｏｘ３的表达量逐渐上升，在第１７天表达量最高，　Ｐａｘ６基因早期可检测到微量表达，在随后的培养中，其　表达量维持在一个稳定的较高水平，Ｓｏｘｌ的表达类似　Ｐａｘ６基因的表达。在ＮＢ体系下的ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体　中，Ｓｏｘ３始终维持了一个较低水平的表达，其表达量与　ＨＥＦ体系下ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体第１天的表达量相当，　Ｐａｘ６￣Ｓｏｘｌ基冈在整个拟胚体培养过程中没有检测到　表达。　来源的拟胚体中，只有少数几个拟胚体出现囊腔，在Ｎ　Ｂ４０￣ＮＢ１　００培养条件下ｈＥＳＣｓ（Ｐ２７＋５６）来源的拟胚　体中则没有观察到囊化拟胚体的出现，见图１。　在中胚层分化基因检测中，检测了早期中胚层标记　基因Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ的表达，结果显示在ＨＥＦ体系下ｈＥＳＣｓ　来源的拟胚体中，Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ基因第１天存在微量表达，　随后出现稍高的稳定表达，在ＮＢ体系下ｈＥＳＣｓ来源的　拟胚体中，不同ＦＧＦ２浓度条件下的培养的ｈＥＳＣｓ来源　的拟胚体表现出明显的差别，ＮＢ４条件下ｈＥＳＣｓ来源的　拟胚体只在第１，４天出现了Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ的表达，其表达　量与同时问点ＨＥＦ体系下ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体相当，而　在ＮＢ４０和ＮＢ１Ｏ０条件下ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体中始终没　ａ：ＨＥＦ　ｓｙｓｔｅｍ；ｂ．ｃ：　ＮＢ４　ｓｙｓｔｅｍ；ｄ．ｅ：ＮＢ４　０　ｓｙｓｔｅｍ；ｆ，ｇ：ＮＢ１００　ｓｙｓｔｅｍ　有检测到Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ的表达。　在内胚层分化基因的检测中，检测了内胚层基因　Ｓｏｘｌ７，ＧＡＴＡ６，ＡＦＰ。Ｓｏｘｌ７基因在ＨＥＦ体系ｈＥＳＣｓ　来源的拟胚体中从第４天开始出现表达，然后随着拟胚　体培养时问的延长逐渐增强，Ｄ１７达到最高表达水平，　ａ：Ｃｙｓｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ＥＢｓ　ｆｒ０ｍ　ｈＥＳＣｓ（Ｐ７０）ｕｎｄｅｒ　ＨＥＦ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｎ　ｄ　１　７：ｂ．ｄ．ｆ：Ｃｙｓｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｓ　ｅｗｅｒｅ　ｎｏｔ　ｉｎ　ＥＢｓ　ｆｒ０ｍ　ｈＥＳＣｓ　而在ＮＢ体系下ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体中，Ｓｏｘｌ７基因在　（Ｐ２７＋６５）ｕｎｄｅｒ　ＮＢ４，ＮＢ４０　ａｎｄ　ＮＢ１００　ｓｙｓｔｅｍ；ｃ，ｅ，ｇ：Ｗｈｅｎ　ｈＥＳＣｓ　ｕｎｄｅｒ　ＮＢ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｂａｃｋ　ｔｏ　ＨＥＦ　ｓｙｓｔｅｍ。ｔｈｅ　ｃｙｓｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｒｍｅｄ　ｉｎ　ＥＢｓ　ｆｎＤｍ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｈＥＳＣｓ　ｏＲ　ｄ　１７．　ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ　ｉｎ　ＥＢｓ　ｆｒｏｍ　ｈＥＳＣｓ　ｕｎｄｅｒ　ＮＢ４　ｓｙｓｔｅｍ．　Ｄ１开始就出现低水平表达，在随后的培养中，其表达并　没有提高和增强；ＡＦＰ基因在ＨＥＦ体系下ｈＥＳＣｓ来源的　拟胚体中，从Ｄ４开始出现表达，随着拟胚体培养时问的　延长，ＡＦＰ基因的表达得到了极大的增强，而在ＮＢ体系　Ｆｉｇｕｒｅ　１　Ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ｈＥＳＣｓ）ｕｎｄｅｒ　ＨＥＦ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ＮＢ　ｓｙｓｔｅｍ　ｅｘｈｉｂｉｔｅＪ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｂｏｄｉｅｓ（ＥＢｓ）ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ（ｘ４０）　图１　ＨＥＦ体系Ｆ和ＮＢ体系下ｈＥＳＣｓ所形成的拟胚体表　现ｍ不同的形态特征（ｘ４０）　下ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体中，不同成纤维细胞生长因子　２浓度对ＡＦＰ的表达存在影响，在ＮＢ４中，ＡＦＰ基因从　Ｄ１开始就出现了ＡＦＰ的表达，随着培养时问的延长，　ＩＳｓＮ　１６７３—８２２５　ＣＮ　２１－１　５３９，Ｒ　ｃｏＤＥＮ：ｚＬＫＨＡＨ　７５１５　ＷＷＷ．ＣＲＴＥＲ．０ｒｇ　ＡＦＰ的表达强度有所增加，但是其表达强度不￣ＩＨＥＦ体　系下ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体，而在ＮＢ４０￣ＩＮＢＩＯ０中，虽　然从Ｄ１开始就可以检测到ＡＦＰ的表达，但是随着培养时　间的延长，ＡＦＰ的表达强度反而逐渐降低：ＧＡＴＡ６基因　在ＨＥＦ￣ＩＮＢ体系一ＦｈＥＳＣｓ来源的拟胚体中的表达模式　与Ｓｏｘｌ　７基因类似，见图２。　ＮＢ４　１　２　３　４　５　６　ＮＢ４０　ＮＢ１Ｏ０　１　２　３　４　５　６　１　２　３　４　５　６　＝＝＝　｝－－－，‘・‘　‘■銎ｊ　ｒ—————————－１　Ｉ…一　’ｌ　Ｅ＝＝＝＿－＿　一ｌ————＿——＿一　【．．．．．．．．．．．．．．．．　Ｉ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．＿＿　麈　ＮＰ，４０　一　ＮＢ　０Ｏ　～　：　：　ｌ　ｌＩ　　Ｉ鼍皇量置　一Ｆ附　嘲嗍　刚　　∞　椭　刚　１：Ｄ１：２：Ｄ４；３：Ｄ７：４：Ｄ１０：５：Ｄ１３：６：Ｄ１　７　　　１：Ｄ１：２：Ｄ４；３：Ｄ７；４：Ｄ１Ｏ：５：Ｄ１３：６：Ｄ１７　Ｆｉｇｕｒｅ　３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉ—ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｒｅｅ　ｇｅｒｍ　ｌａｙｅｒ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｂｏｄｉｅｓ　ｆｒ０ｍ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ｈＥＳＣｓ）ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｆｒ０ｍ　ＨＥＦ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ＮＢ　ｓｖｓｔｅｍ　图３　ＮＢ培养体系转回ＨＥＦ体系ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体　对多能性基因和三胚层分化蕊因表达　Ｆｉｇｕｒｅ　２　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉ－ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｒｅｅ　ｇｅｒｍ　ｌａｙｅｒ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｂｏｄｉｅｓ　ｆｒＯｍ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ｈＥＳＣｓ）ｕｎｄｅｒ　ＨＥＦ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ＮＢ　ｓｙｓｔｅｍ　２．４　多能性基因Ｎａｎｏｇ和神经外胚层分化基因（Ｐａｘ６　圈２　ＨＥＦ和ＮＢ培养体系下ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体对多　能性基因和三胚层分化基因表达　和Ｓｏｘ１）在ＨＥＦ和ＮＢ体系间表现出可逆性表达变化　在多能性基因和分化基因的检测中，２体系表现出明显　变化的基因主要为Ｎａｎｏｇ、Ｐａｘ６￣ｌＳｏｘｌ基因，见图４。　２．３　ＮＢ培养体系下ｈＥＳＣｓ转回ＨＥＦ体系后在拟胚体　分化中恢复分化能力　当在ＮＢ培养体系下长期培养的　ｈＥＳＣｓ转回￣ＩＨＥＦ体系后培养１３代后，在拟胚体分化检　测中发现，虽然多能性基因仍然维持高水平的表达，但　是分化基因的表达有所恢复。　在外胚层分化基因中，Ｐａｘ６￣ｌＳｏｘｌ在ＮＢ４体系下　一一　在拟胚体分化中，ＨＥＦ体系下ｈＥＳＣｓＸ，￣多能性基因　Ｎａｎｏｇ的表达呈现一个下降的趋势，而神经分化基因表　现一个逐渐上升的趋势。　在ＮＢ体系中，％１１性基因Ｎａｎｏｇ的表达呈现出一个　逐渐卜升的表达趋势，神经分化基因没有检测到表达。　当ｈＥＳＣｓ由ＮＢ体系转回５１ＪＨＥＦ体系后，多能性基　因Ｎａｎｏｇ的表达维持相对较低的水平，ＮＢ４体系下　转回的ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体随着悬浮培养时间的延长　而逐渐增强，而ＮＢ４０￣ＩＮＢ１００体系下转回的ｈＥＳＣｓ来　源的拟胚体对于Ｐａｘ６的表达早期维持极低水平表达，于　第１３天才明显表达，Ｓｏｘｌ的表达类￣Ｐａｘ６基因的表达。　在中胚层分化基因中，Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ基因的表达在　ＮＢ４体系转回的ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体中从第１天开始出　现第水平表达，随着悬浮培养时间的养成而逐渐增强，　ＮＢ４０￣ＩＮＢ１００体系下转回的ｈＥＳＣｓ来源的拟胚体对　Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ的表达同样出现延迟。　对于内胚层分化基因，Ｓｏｘｌ７、ＡＦＰ￣ＩＧ　ｒＡ６基因　的表达模式类似，由转回前的低表达水平逐渐降甚至不　表达，到转会后的表达逐渐增高，Ｓｏｘｌ７和ＧＡＴＡ６在　ＮＢ４０￣ＩＮＢ１００转回后出现出表达延迟，到第１３天才出　现表达，见图３。　７５１６　ｈＥＳＣｓ转回ＨＥＦ体系后所形成的拟胚体ＸＣＮａｎｏｇ表现　出一个下降的趋势，神经分化基因Ｐａｘ６￣ｌＳｏｘｌ的表达　得到较完全或部分恢复，ＮＢ４体系转回后神经分化基因　的恢复较完全，其表达水平达￣４ＪＨＥＦ体系，而ＮＢ４０￣Ｉ　ＮＢ１００体系恢复　完全，表达水平远低于ＨＥＦ体系。　２．５　ＮＢ体系下ｈＥＳＣｓ表现出高ｈＥＳＣｓ分子标记纯度，　转回饲养细胞体系后降低ｈＥＳＣｓ在ＮＢ体系下表现出　高的ＳＳＥＡ－４阳性细胞纯度，ＳＳＥＡ＿４阳性细胞纯度在　ＨＥＦ、ＮＢ４、ＮＢ４０和ＮＢ１００体系下分￣ｔ（８１．５＋５．４６）％，　（９７．３＋０．８）％，（９５．５±２＿５）％和（９５．９±２．４）％，当ｈＥＳＣｓ在　ＮＢ体系培养７０代后转回￣ｔＨＥＦ体系培养２０代时，ＳＳＥＡ４　阳性细胞纯度分别为（８９．２＋１．９）％，（８５．８＋１．２）％，　（８７．９±０＿７）％，见图５。　Ｐ０．Ｂｏｘ　１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００４　ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｒｎ　罗树伟．等．不两培养体系司逆改变Ａ类轾骀于缎匏的分纯倾向　鼠胚胎干细胞分离培养体系演变而来，是一种出现较早　的ｈＥＳＣｓ培养体系，与小鼠胚胎干细胞培养体系不同的　是加入的外源性的细胞因子不同，ｈＥＳＣｓ饲养细胞培养　体系加入的是ＦＧＦ２，而小鼠胚胎干细胞培养体系加入　的是白血病抑制因子　Ｊ。　随着对ｈＥＳＣｓ临床应用要求的提高，无饲养细胞培　养体系相继建立，所有的这些培养体系都可以维持　ｈＥＳＣｓ处于未分化状态，不同的培养体系提供不同的培　养环境，而ｈＥＳＣｓ对体外培养环境具有一定适应　性　酬　在ｈＥＳＣｓ的实际培养过程中，ｈＥＳＣｓ可以分为　不同的亚群【　。　在本实验结果中，作者发现不同的培养体系（饲养细　胞培养体系ＨＥＦ体系和化学限定性培养体系ＮＢ体系）可　以改变ｈＥＳＣｓ分化的倾向，当ｈＥＳＣｓ有饲养细胞转入到　ＮＢ体系中后，ｈＥＳＣｓ体外经拟胚体分化时受到，　主要表现在向外胚层细胞分化上，神经发育基因ＰａＸ６　￣ＮＳｏｘｌ表达抑制。当ｈＥＳＣｓ再有ＮＢ体系转回到饲养细　胞培养体系时，期受限的分化潜能得到可以的恢复，尤　其是在ＮＢ４培养体系下。与此同时，作者发现在拟胚体　基因表达中，Ｎａｎｏｇ的高表达与神经分化抑制，Ｎａｎｏｇ　的低表达或表达趋势Ｆ降与神经抑制恢复相关，作为多　能性基因的Ｎａｎｏｇ可以直接抑；￣ｌＪＰａｘ６基因的表达，抑制　向神经分化　，Ｎａｎｏｇ的高表达可以抑制人类胚胎干　Ｊ，Ｎａｎｏｇ基因的表达在诱导分　细胞形成的拟胚体分　化倾向中起关键性的作用。在ＮＢ体系中，ｈＥＳＣｓ）Ｊ：ＩＩ入　的ＦＧＦ２浓度对ｈＥＳＣｓ体外分化倾向同样存在影响，　ｈＥＳＣｓ在高ＦＧＦ２浓度环境培养下，其向神经外胚层分　化受到明显的影响，分化受限恢复难度呈现ＦＧＦ２浓度　相关，ＦＧＦ２浓度越高分化潜能恢复越困难。ｈＥＳＣｓ中　ＳＳＥＡ－４阳性细胞与分化倾向发生一致性的波动，由　ＨＥＦ体系下的较低比例到转入ＮＢ体系下的高比例，在　芑　旦　到转回ＨＥＦ体系的较低比例，ｈＥＳＣｓ在不同培养体系下　的分化潜能与ＳＳＥＡ一４阳性比例高低存在～定的相关　５　８　性，ｈＥＳＣｓ诱导分化倾向和ｈＥＳＣｓ亚群（￣ｌｌＳＳＥＡ－３１；Ｈ性　细胞亚群￣ＮＴＲＡ－１—６０阳性细胞亚群）之间的关系需进一　步研究和阐明。ｈＥＳＣｓ由ＮＢ体系转入ＨＥＦ体系，其分　篙　＆　ｃ，）　Ｃ力　化倾向没有得到完全的回复，同时在拟胚体分化中高表　ＨＥＦ　ｓｙｓｔｅｍ　ＮＢ　ｓｙｓｔｅｍ　ＮＢ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｆｒＯｍ　达多能性基因ＯｃＩ４和Ｎａｎｏｇ，一个可能的原因是在转回　￣ＩＪＨＥＦ体系时，培养的代数较少，ＳＳＥＡ－４阳性细胞比　例下降不够充分，延长在ＨＥＦ体系培养时间有可能完全　恢复ｈＥＳＣｓ分化倾向。从这个意义上来讲，不同的　ｈＥＳＣｓ培养体系具有各自特有的诱导分化倾向，不同培　养体系（饲养细胞培养体系和化学限定性培养体系）问可　以相＿瓦转变，且与ｈＥＳＣｓ细胞亚群相关。将ｈＥＳＣｓ进行　ＨＥＦ　ｓｙｓｔｅｍ　Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ｈＥＳＣｓ）ｕｎｄｅｒ　ＨＥＦ　ｓｙｓｔｅｍ，ＮＢ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ＮＢ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ＨＥＦ　ｓｙｓｔｅｍ　ＨＥＦ体系下和ＮＢ体系下ｈＥＳＣｓ分了：标记ＳＳＥＡ－４　流』　分析　３讨论　诱导分化时，应该采取相应的培养体系，如向神经细胞　诱导分化时宜采用饲养细胞体系。　本实验结果为研究ｈＥＳＣｓ诱导分化倾向提供了新　７５１７　ｈＥＳＣｓ最初的培养体系为饲养细胞培养体系，由小　７　ｗ—ｃＲ珊ｌｏｒｇ　的思路。　零槌伟．等．不嗣培养体系司逆改变人类旺雅于细瞻的分｛艺倾向　ｆ２４１　Ｂａｋｅｒ　ＤＥ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ　ＮＪ　Ｍａｌｔｂｙ　Ｅ．ｅｔ　ａＩ．Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｂｒｅｙｏｎｉｃ　ｓｔｍ　ｃｅｌｅｌｓ　ａｎｄ　ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．２００７：２５（２）：２０７—２１５．　ｆ２５】　Ｂｒａａｍ　ＳＲ．Ｄｅｎｎｉｎｇ　Ｃ．Ｍａｔｓａ　Ｅ。ｅｔ　ａ１．Ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　４参考文献　【１１　Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ。ｌｔｓｋｏｖｉｔｚ－ＥＩｄｏｒ　Ｊ．Ｓｈａｐｉｒｏ　ＳＳ。ｅｔ　ａ１．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　ＣｅｌＩ　Ｌｉｎｅｓ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１　９９８；２８２：　１１４５－１１４７．　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｒｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｏｎｄｉｃｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｅ忏ｉｃｉｅｎｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍｏｄｉｉｆｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ　Ｐｒｏｔｏｃ．２００８；３（９）：１４３孓１４４３．　ｆ２６１　Ｈａｒｒｉｓｏｎ　ＮＪ，Ｂａｒｎｅｓ　Ｊ，Ｊｏｎｅｓ　Ｍ．ｅｔ　ａ１．ＣＤ３０　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒｅｖｅａｌｓ　ｔｈａｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｄａｐｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｍ　ｃｅｌｅｌｓ．Ｓｔｍ　ｅＣｅｌｌｓ　２００９；２７（５）：１０５７—１０６５．　ｆ２７１　ＢｅｎｄａｌＩ　ＳＣ，Ｓｔｅｗａｒｔ　ＭＨ。Ｍｅｎｅｎｄｅｚ　Ｐｌ　ｅｔ　ａ１．ＩＧＦ　ａｎｄ　ＦＧＦ　ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｓｔｅｒｎ　ｃｅｌＩ　ｎｉｃｈｅ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　【２】　Ｋｉｍ　ＳＪ，Ｓｏｎｇ　ＣＨ，Ｓｕｎｇ　ＨＪ。ｅｔ　ａＩ．Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｃｅｎｔａ　Ｆｅｅｄｅｒ　Ｌａｙｅｒｓ　Ｓｕｐｐｏｒｔ　Ｕｎｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｔｅｒＳｒ　Ｃｅｌｌｓ　ｆ３】　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｄｅｖ．２００７；１　６（３）：４２１－４２８．　Ｙｏｏ　ＳＪ．Ｙｏｏｎ　ＢＳ。ＫＩｍ　ＪＭ。ｅｔ　ａＩ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ．２００７；４４８（７１５７）：１Ｏ１　５＿１０２１．　【２８】　Ｂｏｙｅｒ　ＬＡ，Ｌｅｅ　ＴＩ．Ｃｏｌｅ　Ｍ　ｅｔ　ａ１．Ｃｏｒｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌ１．２００５；１　２２（６）：　９４７—９５６．　ｆ４】ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌｓ．　Ｅｘｐ　ＭｏＩ　Ｍｅｄ．２００５；３７（５）：３９９－４０７．　Ｌｅｅ　ＪＢ．Ｓｏｎｇ　ＪＭ。Ｌｅｅ　ＪＥ．Ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｈｕｍａｎ　ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｂｒｅｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．　ｆ２９】　Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ　ＢＥ，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ　ＴＳ．Ｘｉｅ　Ｘ，ｅｌ　ａ１．Ａ　ｂｉｖａｌｅｎｔ　ｃｈｒｏｍａｔｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｍａｒｋｓ　ｋｅｙ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａＩ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｍｂｒｅｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．　ＣｅｌＩ．２００６；１２５（２）：３１５－３２６．　ｆ３０１　Ｙａｓｕｄａ　ＳＹ　Ｔｓｕｎｅｙｏｓｈｊ　Ｎ。Ｓｕｍｉ　ｅｌ　ａＩ．ＮＡＮＯＧ　ｍａｉｎｔａｉｎｓ　ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａＩ　ｏｆ　Ｄｎｍａｔｅ　ＥＳ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｆｅｅｄｅｒ　Ｉａｙｅｒ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ．２００６；１１（９）：１１１　５－１１２３．　【５】２００４；１　２８（６）：７２７．７３５．　Ｌｕｄｗｉｇ　ＴＥ，Ｂｅｒｇｅｎｄａｈｌ　Ｖ’Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ　ＭＥ。ｅｔ　ａ１．Ｆｅｅｄｅｒ．　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　【６】２００６；３（８）：６３７－６４６．　Ｌｕｄｗｉｇ　ＴＥ，Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ　ＭＥ。Ｊｏｎｅｓ　ＪＭ。ｅｔ　ａＩ．Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｂｒｙｏｎｉｅｃ　ｓｔｍ　ｅｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００６；２４　【７】　ｆ２）：１８５－１８７．　Ｂｅｎｄａｌｌ　ＳＣ，Ｓｔｅｗａｒｔ　ＭＨ．Ｍｅｎｅｎｄｅｚ　ｅｔ　ａ１．ＩＧＦ　ａｎｄ　ＦＧＦ　ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌＩ　ｎｉｃｈｅ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　来自本文课题的更多信息一　謇ｌ盆　资助。　课题受国家自然科学基金（２００６ＡＡ０２Ａ１０２）　ｈｕｍａｎ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ　２００７；４４８（７１　５７１：１　０１　５．１　０２１．　【８】　Ｘｉｅ　ＣＱ，Ｌｉｎ　Ｇ．Ｌｕｏ　ＫＬ，ｅｔ　ａ１．Ｎｅｗｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｉｆｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｉｎａｃｔｉｖｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２００４；３１５（３）：５８１—５８８．　“人类胚胎干细胞建系和向神经细胞及造血细胞诱导分化”　ｆ９】Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ　ＭＥ，Ｌｕｄｗｉｇ　ＴＥ，Ｘｕ　ＲＨ．ｅｔ　ａ１．Ｂａｓｉｃ　ＦＧＦ　Ｓｕｐｐｏｒｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　ＣｅｌＩ　Ｓｅｌｆ－ＲｅｎｅｗａＩ．Ｓｔｅｒａ　Ｃｅｌｌｓ．２００６；　镒　晃　课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济　组织直接或间接的经济或利益的赞助　梁髫　点实验的创新主要在于理论创新，得到了　２４（３）：５６８－５７４．　ｆ１　０】　Ｘｕ　ＲＨ，Ｐｅｃｋ　ＲＭ，Ｌｊ　ＤＳ．Ｂａｓｉｃ　ＦＧＦ　ａｎｄ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＢＭＰ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ＳＵＳｔａｉｎ　ｕｎｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＥＳ　ｃｅｌｌｓ．　Ｎａｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５；２（３）：１　８孓１　９Ｏ．　【１　１】　Ｙａｏ　Ｓ，Ｃｈｅｎ　Ｓ，Ｃｌａｒｋ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａＩ　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｄｉｆｆｅｌｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｒａ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　国家自然科学基金项目的资助，在国内外首次比较了不同人　类胚胎干细胞培养体系对其诱导分化的影响，发现人类胚胎　干细胞在不同的培养体系下表现出不同的诱导分化倾向，该　种诱导分化倾向具有可逆性，与人类胚胎干细胞分子标记细　胞比例相关。　壤髫殍　“金　拦　：对于人类胚胎干细胞体外分　化实验，国际经典的方法是在体外形成拟胚体，然后检测　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．２００６；１０３ｆ１８）：６９０７—６９１２．　【１　２】　Ｓａｔｏ　Ｎ．Ｍｅｉｈｅｒ　Ｌ，Ｓｋａｌｔｓｏｕｎｉｓ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ａｎｄ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｂｙ　ａ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａＩ　ＧＳＫ．３－ｓｐｅｃｉｉｃ　ｉｆｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｎａｔ　Ｍｅｄ．２００４；６：５５－６３．　ｆ１　３】　Ｘｕ　ＣＨ．Ｉｎｏｋｕｍａ　ＭＳ，Ｄｅｎｈａｍ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｆｅｅｄｅｒ—ｆｒｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｕｎｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｍ　ｃｅｌｅｌｓ　Ｎａｔ　ＢｉｏｔｅｃｈｏＩ　２００１：１９：９７１—９７４．　ｆ１４】　Ｂｅｅｔｔｉｅ　ＧＭ．Ｌｏｐｅｚ　ＡＤ，Ｂｕｃａｙ　Ｎ，ｅｔ　ａＩ．　Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ　ｍａｉｎｔａｉｎｓ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆ　多能行基因和三胚层分化基因的表达情况，以此说明人类　胚胎干细胞分化潜能。本实验对于人类胚胎干细胞分化倾　向的研究采用了扭胚体分化方式，比较和分析了多能性基　因和三胚层分化基因的相对表达　。　ｆｅｅｄｅｒ　Ｉａｙｅｒｓ，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．２００５；２３（４）：４８９—４９５．　【１５】　Ｊａｍｅｓ　Ｄ，ＬｅｖｉｎｅＡＪ，Ｂｅｓｓｅｒ　Ｄ，ｅｔ　ａＩ．ＴＧＦＢ／ａｃｔｉｖｉｎ／ｎｏｄａｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｓ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｏｆ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｍ　ｅｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００５；１３２（６）：１２７３．１２７８．　【１６１　Ｏｇａｗａ　Ｋ。Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ　Ｒ。１ｗａｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａ１．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｎｔ　ａｎｄ　ＬＩＦ　ｌｎ　ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ＥＳ　ｃｅｌｌｓ．・　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．２００６；３４３（１　１：１　５９—１　６６．　【１７】　Ｌｕ　Ｊ，Ｈｏｕ　Ｒ．Ｂｏｏｔｈ　ＣＪ．ｅｔ　ａ１．Ｄｅｆｉｎｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｍ　ｃｅｌｅｌｓ．Ｐｒｏｃ　ＮａｔＩ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．２００６；１　０３（１　５）：　５６８８—５６９３．　或漂题功　鲔．　层：在课题设计中，主要存在的　不足是所比较培养体系为饲养细胞培养体系和无饲养细胞　培养体系，以及在无饲养细胞培养体系下成纤维细胞生长因　子２务件下对人类胚胎千细胞分化倾向的影响，没有对多　种饲养细胞体系和多种无饲养细胞体系进行横向比较。　撂　猫屎僧筌的　篮　实验结果说明，不同的人类胚胎　［１８１　Ｚｈｏｕ　Ｊ，Ｏｕ—Ｙａｎｇ　Ｑ．Ｌｉ　Ｊ。ｅｔ　ａＩ．Ｈｕｍａｎ　ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ　ｅｎｄｏｄｅｒｍ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｍ　ｅｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｄｅｖ．２００８；１　７（４）：７３７—７４９．　【１　９］Ｌｉｎ　Ｑ　Ｘｉｅ　Ｏｕｙａｎｇ　Ｑ。ｅｔ　ａ１．ＨＬＡ－ｍａｔｃｈｉｎｇ　ｐｏｔｅｎｔｉａＩ　ｆ　ａｎ　ｏｓｔｅａｂｌｉｓｈｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｍｂｒｅｙｏｎｉｃ　ｓｔｍ　ｃｅｌｅｌ　ｂａｎｋ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ．ＣｅｌＩ　Ｓｔｅｍ　ＣｅｌＩ．２００９；５（５）：４６１—４６５．　【２０】　Ｅｖａｎｓ　Ｍ，Ｋａｕｆｒｎａｎ　Ｍ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｊｎ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｌｕｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｍｏｕｓｅ　ｍｂｒｅｙｏｓ　Ｎａｔｕｒｅ．１９８１；２９２：１５４—１５６．　干细胞培养体系对其体外诱导分化具有不同的影响，如本实　验所采用的无饲养细胞培养体系下的人类胚胎干细胞向神　经外胚层的分化受到抑制．在诱导人类胚胎干细胞向神经细　胞分化时，不合适采用该无饲养细胞培养体系采培养胚胎干　细胞，而宜采用饲养细胞培养体系或其他培养体系，为人类　ｆ２１】　Ｍａｒｔｉｎ　ＧＲ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｃｅｌｌＪｉｎｅ　ｆｒｏｍ　ｅａｒｌｙ　ｍｏｕｓｅ　ｅｍｂｒｙｏ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｂｙ　ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｓｔｅｍ　ｅｌｃｌｓ．Ｐｒｏｃ　ＮａｔＩ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．１９８１；７８（１２）：７６３４．７６３８．　【２２１　ＹａｎｇＳ，ＬｉｎＧ　ＴａｎＹＱ，ｅｌ　ａＩ．Ｔｕｍｏｒ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ－ａｄａｐｔｄ　ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｅｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｄｕｒｉｎｇ　Ｊｏｎｇ・ｔｅｒｍ　胚胎干细胞定向诱导分化提供新的线索。　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｇｅｎｅｓ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　Ｃａｎｃｅｒ．２０Ｏ８：４（８）：６６５—６７９．　【２３】　Ｉｍｒｅｈ　Ｍ　Ｇｅｒｔｏｗ　Ｋ，ＣｅｄｅｒｖａｌＩ　Ｊ。ｅｔ　ａ１．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆａｖｏｒｉｎｇ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａＩ　ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ＥＳ　ｃｅｌｌｓ．Ｊ　ＣｅｌＩ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２Ｏ０６：９９（２）：５０８—５１６．　７５１８　Ｐ　ｏ．Ｂｏｘ　１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１１０００４　ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ