(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107001407 A(43)申请公布日 2017.08.01
(21)申请号 201580041180.0(22)申请日 2015.05.28(30)优先权数据
62/004,175 2014.05.28 US14/668,820 2015.03.25 US(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2017.01.24(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/US2015/033048 2015.05.28(87)PCT国际申请的公布数据
WO2015/184183 EN 2015.12.03(71)申请人 建新公司
地址 美国马萨诸塞州
(72)发明人 R·科杜里 K·P·布劳尔
V·瓦里库 M·于 C·黄 (54)发明名称
通过加入还原剂控制蛋白溶液中二硫键的形成
(57)摘要
本发明公开了经开发以控制通过生物过程所产生的多聚体蛋白的多肽之间二硫键形成的方法。还公开了允许控制二硫键形成的蛋白溶液参数。在一个实例中，本发明公开的方法能够用于控制半抗体分子在抗体溶液中的比例。
K·康斯坦丁诺夫 J·尹
(74)专利代理机构 北京市嘉元知识产权代理事
务所(特殊普通合伙) 11484
代理人 陈静(51)Int.Cl.
C07K 1/113(2006.01)C07K 16/00(2006.01)
权利要求书2页 说明书28页 附图12页
CN 107001407 ACN 107001407 A
权 利 要 求 书
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1.一种控制通过生物过程产生的多聚体蛋白的多肽之间二硫键数目的方法，该方法包括：
在所述生物过程中特定的时间点将所述多肽与调理的溶液接触，其中所述调理的溶液包含一个或多个预定的溶液参数，及
将包含所述多肽的调理的溶液在预定的温度温育预定的时间；
其中所述多肽与调理的溶液的温育控制蛋白的多肽之间二硫键的形成。2.权利要求1的方法，其中所述蛋白的多肽之间的二硫键数目增加。3.权利要求1的方法，其中所述蛋白的多肽之间的二硫键数目减少。4.权利要求1的方法，其中所述蛋白的多肽之间的二硫键数目得以维持。5.权利要求1的方法，其中所述预定的溶液参数包括如下一个或多个：氧化还原试剂本体、氧化还原试剂浓度、pH、气体本体、溶解的气体水平、电导率和活细胞密度。
6.权利要求5的方法，其中所述氧化还原试剂本体是2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺(dithiobutylamine)或亚硫酸钠。
7.权利要求6的方法，其中所述氧化还原试剂本体是2-巯基乙胺(2-MEA)。8.权利要求6的方法，其中所述氧化还原试剂的摩尔浓度与蛋白的摩尔浓度比是至少约4:1、8:1、16:1或32:1。
9.权利要求1的方法，其中所述温育的预定温度是约2℃至约23℃。10.权利要求1的方法，其中所述温育的预定温度是约23℃至约37℃或更高。11.权利要求1的方法，其中在温育期间混合包含所述多肽的调理的溶液。12.权利要求1的方法，其进一步包括：在所述生物过程中的特定时间点将所述多肽从生物过程移出。
13.权利要求12的方法，其进一步包括：在温育之后将所述多肽返回至所述生物过程。14.权利要求1的方法，其中所述生物过程包括分批、半连续或连续生物过程。15.权利要求1的方法，其中所述生物过程中的特定时间点包括生物过程中在生物反应器操作或补料分批细胞培养操作之后的时间点。
16.权利要求1的方法，其中所述生物过程中的特定时间点包括其中所述多肽处于包含多个细胞的溶液中的时间点。
17.权利要求16的方法，其中所述生物过程中的特定时间点包括其中所述多肽位于包含多个细胞的生物反应器、容纳槽或非生物反应器单元操作容器中的时间点。
18.权利要求1的方法，其中所述生物过程中的特定时间点包括其中所述多肽处于无细胞溶液中的时间点。
19.权利要求18的方法，其中所述生物过程中的特定时间点包括其中所述多肽位于容纳槽中的时间点。
20.权利要求18的方法，其中所述生物过程中的特定时间点包括在病毒灭活、调整、色谱、过滤、稀释、浓缩步骤或任何无细胞的生物过程步骤过程中的时间点。
21.权利要求18的方法，其中所述生物过程中的特定时间点包括在生物过程的澄清阶段、澄清的收获物阶段、捕获阶段、中间色谱阶段(intermediate chromatography stage)或精修色谱阶段(polishing chromatography stage)过程中的时间点。
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权 利 要 求 书
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22.权利要求18的方法，其中所述无细胞溶液包含澄清的收获物。23.权利要求18的方法，其中所述无细胞溶液包含蛋白A洗脱液。24.权利要求1的方法，其中所述多聚体蛋白是非抗体蛋白。25.权利要求1的方法，其中所述多聚体蛋白是抗体。26.权利要求1的方法，其中所述多聚体蛋白是抗体片段。27.权利要求25或26的方法，其中所述多聚体蛋白的多肽包含重链多肽。28.权利要求25或26的方法，其中所述多聚体蛋白的多肽包含轻链多肽。29.权利要求25或26的方法，其中所述多聚体蛋白的多肽包含重链多肽和轻链多肽。30.权利要求1的方法，其中所述多肽是蛋白的单体或多聚体。
31.一种控制半抗体分子在包含抗体分子群体的溶液中的比例的方法，该方法包括：将所述包含抗体分子群体的溶液与调理的溶液接触，其中所述调理的溶液包含预定的溶液参数；及
将包含所述抗体分子的调理的溶液在预定的温度温育预定的时间；
其中所述抗体分子与调理的溶液的温育控制半抗体分子在调理的抗体溶液中的比例。32.权利要求31的方法，其中所述预定的溶液参数包括氧化还原试剂选择、氧化还原试剂浓度、pH、气体选择、溶解的气体水平、电导率、活细胞密度或蛋白浓度。
33.权利要求25或31的方法，其中所述抗体是IgG4抗体。34.权利要求31的方法，其中所述抗体是抗体片段。35.权利要求26或34的方法，其中所述抗体片段是IgG4抗体片段。36.权利要求31的方法，其中半抗体分子在调理的抗体溶液中的比例为低于30％。37.权利要求31的方法，其中半抗体分子在调理的抗体溶液中的比例为低于15％。38.权利要求33的方法，其中所述抗体溶液包含那他珠单抗(natalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)或夫苏木单抗(fresolimumab)。
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说 明 书
通过加入还原剂控制蛋白溶液中二硫键的形成
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[0001]
相关申请
[0002]本申请要求2015年3月25日递交的美国专利申请No.14/668,820的优先权，其要求2014年5月28日递交的美国临时申请No.62/004,175的权益，其公开内通过提述明确并入本文。
技术领域
[0003]本发明涉及重组蛋白和抗体的生物技术以及生物制造的方法。[0004]发明背景
[0005]蛋白的多肽之间的二硫键形成是正确的蛋白装配和结构的一个关键方面。蛋白的多聚化可能依赖于多肽(例如多肽单体/多聚体)之间形成充分水平的二硫键。抗体代表一类蛋白，其特别依赖于二硫键形成。[0006]抗体通常由四个多肽构成，即两条轻链和两条重链(L:H:H:L)。大多数抗体在四条多肽链之间含有二硫键。重链多肽之间的二硫键有时不会形成，导致形成在两对重链和轻链之间不含链间二硫键的抗体。通常而言，参见图1。这些抗体已被称为半抗体(在本文中缩写为“Hab”)。
[0007]一些抗体类别和类型更容易形成半抗体，如免疫球蛋白G，亚型4(本文缩写为“IgG4”)的抗体。在天然抗体和重组抗体二者的生产中，显著比例的IgG4(至少高达35％)被制成半抗体(Miesages等,2012,Biotechnol Bioeng.109(8):2048-58)。[0008]在生理条件下，由于两个重链-轻链抗体半部之间的强力非共价相互作用，半抗体通常作为完整的、功能性抗体存在，尽管缺乏链间二硫键。(Rose等,2011,Structure,19(9):1274-82)。半抗体形成与异常蛋白的形成相关(参见图1)。例如，IgG4抗体中的半抗体形成可能是由于铰链区的一级氨基酸序列和结构，其导致IgG4抗体能够进行动态的Fab臂交换，其中两个抗体能够彼此重组以形成双特异性抗体。(参见例如，美国专利No.4,470,925；美国专利申请公开No.US 2011/0086366 A1)。IgG4亚型的这种特征可能是由铰链区柔性的增加引起的，这使其更容易形成环状链内二硫键。(Bloom等,1997,Protein Sci.6(2):407-15；Schuurman等,2001,Mol Immunol.38(1):1-8)。半抗体的形成可以追溯到重链恒定域中的缺失，如在某些骨髓瘤中产生的抗体中(Spiegelberg等,1975,Biochemistry 14(10):2157-63)。
[0009]目前尚不知晓半抗体与任何独特的临床症状或毒理学相关。然而，半抗体的水平是产生和/或制造治疗性IgG4抗体的关键质量属性。对于能够用来控制最终药物物质中多聚体蛋白的多肽之间二硫键形成的上游或下游抗体加工条件所达到的程度的了解是贫乏的。
[0010]发明概述
[0011]本文所公开的发明涵盖了经开发用于控制通过生物过程产生的蛋白的多肽之间二硫键形成的方法。一方面，本发明包括用于控制通过生物过程产生的多聚体蛋白的多肽之间二硫键数目的方法。这一方面的一些实施方案包括以下步骤：(a)将多肽在生物过程中
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说 明 书
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特定的时间点与调理的溶液(conditioned solution)接触，其中所述调理的溶液包含一个或多个预定的溶液参数，和(b)将包含该多肽的调理的溶液在预定的温度温育预定的时间，其中所述多肽与调理的溶液的温育控制蛋白的多肽间的二硫键形成。在一些实施方案中，当应用本文公开的方法时，蛋白多肽之间的二硫键数目增加。在其它实施方案中，蛋白多肽之间的二硫键数目减少。而在实施方案中，蛋白多肽之间的二硫键数目得以维持。[0012]在本发明的方法的一些实施方案中，预定的溶液参数包括如下一种或多种：氧化还原试剂本体(redox reagent identity)、氧化还原试剂浓度、pH、气体本体(gas identity)、溶解的气体水平、电导率和活细胞密度。[0013]在本发明的方法的一些实施方案中，氧化还原试剂本体是2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺(dithiobutylamine)或亚硫酸钠。在这些实施方案的一些中，氧化还原试剂本体是2-MEA。在这些实施方案的一些中，氧化还原试剂的摩尔浓度(molarity)与蛋白的摩尔浓度比是至少约4:1、8:1、16:1或32:1。
[0014]在本发明的方法的一些实施方案中，温育的预定温度是约2℃至约23℃。在其它实施方案中，温育的预定温度是约23℃至约37℃或更高。在本发明的方法的一些实施方案中，在温育期间混合包含多聚体蛋白的多肽的调理的溶液。[0015]在一些实施方案中，本发明的方法的生物过程包括分批、半连续或连续生物过程。在一些实施方案中，将多聚体蛋白的多肽在生物过程中的特定时间点与调理的溶液接触，该时间点发生在生物过程中的生物反应器操作和/或补料分批细胞培养操作之后。[0016]在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括在生物过程中的特定时间点将多肽从该生物过程中移出的步骤。在这些实施方案的一些中，本发明的方法进一步包括在温育之后将所述多肽返回至该生物过程的步骤。[0017]本发明的方法的另一方面，将多聚体蛋白的多肽与调理的溶液在生物过程中的特定时间点接触，所述特定时间点是当多肽处于包含多个细胞的溶液中时。在这些实施方案的一些中，所述特定时间点是当多肽位于包含多个细胞的生物反应器、容纳槽或非生物反应器单元操作容器中的时间点。
[0018]在本发明的方法的另一方面，将多聚体蛋白的多肽与调理的溶液在特定时间点接触，所述时间点是当该多聚体蛋白处于无细胞溶液中时。在这些实施方案的一些中，所述特定时间点发生在病毒灭活、调整、色谱、过滤、稀释、浓缩步骤或任何无细胞的生物过程步骤过程中。在其它实施方案中，所述特定时间点发生在生物过程的澄清阶段、澄清的收获物阶段、捕获阶段、中间色谱阶段(intermediate chromatography stage)或精修色谱阶段(polishing chromatography stage)过程中。在这些实施方案的一些中，该生物过程中的特定时间点包括其中所述多肽位于容纳槽中的时间点。在一些其它实施方案中，包含所述多肽的调理的溶液在温育步骤之后的pH是约3.0至约5.0。[0019]在一个实施方案中，含有多聚体蛋白的多肽的无细胞溶液包含蛋白A洗脱液。在另一实施方案中，含有多聚体蛋白的多肽的无细胞溶液包含澄清的收获物。[0020]在本发明的方法的一些实施方案中，多聚体蛋白的多肽是蛋白的单体。在其它实施方案中，多聚体蛋白的多肽是蛋白的多聚体。[0021]在另一方面，根据本发明的方法进行控制的多聚体蛋白是抗体。在这些实施方案
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的一些中，所述多聚体蛋白的多肽包含重链多肽。在其它实施方案中，所述多聚体蛋白的多肽包含轻链多肽。而在其它实施方案中，所述多聚体蛋白的多肽包含重链多肽和轻链多肽。在一个实施方案中，本发明的方法的抗体是IgG4抗体。在另一实施方案中，本发明的方法的抗体包括那他珠单抗(natalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)或夫苏木单抗(fresolimumab)。
[0022]在另一方面，根据本发明的方法进行控制的多聚体蛋白是抗体片段。在这些实施方案的一些中，所述多聚体蛋白的多肽包含重链多肽。在其它实施方案中，所述多聚体蛋白的多肽包含轻链多肽。而在其它实施方案中，所述多聚体蛋白的多肽包含重链多肽和轻链多肽。在一个实施方案中，本发明的方法的抗体片段是IgG4抗体片段。[0023]在另一方面，根据本发明的方法进行控制的多聚体蛋白是非抗体蛋白。在一些实施方案中，所述非抗体蛋白是酶。[0024]在另一方面中，本文公开了一种控制包含抗体分子群体的溶液中半抗体分子的比例的方法。这一方面的一些实施方案包括以下步骤：(a)将包含抗体分子群体的溶液与调理的溶液接触，其中所述调理的溶液包含预定的溶液参数，和(b)将包含该抗体分子的调理的溶液在预定的温度温育预定的时间，其中所述抗体分子与调理的溶液的温育控制调理的抗体溶液中半抗体分子的比例。在这一方面的一些实施方案中，预定的溶液参数包括氧化还原试剂选择、氧化还原试剂浓度、pH、气体选择、溶解的气体水平、电导率、活细胞密度和/或蛋白浓度。
[0025]在一些实施方案中，调理的抗体溶液中半抗体分子的比例低于30％。在其它实施方案中，调理的抗体溶液中半抗体分子的比例低于20％。而在其它实施方案中，调理的抗体溶液中半抗体分子的比例低于15％。[0026]附图简述[0027]图1：能够对其应用控制二硫键形成的生物制造方法的示例性多聚体蛋白的示意图。图1A描绘了完全抗体(左)和半抗体(右)，其中蛋白单体亚基(粗线)通过二硫键(细线)和强力非共价相互作用(星号)彼此缔合。在该实例中，完全抗体含有全部多聚体亚基之间的二硫键，包括两个较大重链亚基之间的链间二硫键。在半抗体中，链间二硫键则作为链内二硫键存在，从而使得重链亚基之间不存在共价键。然而，强力非共价相互作用维持了两个重链亚基之间的强力缔合。完全抗体或半抗体可对单一靶标或对两种不同的靶标(双特异性)具有特异性。图1B描绘了经链间二硫键彼此相连的抗体片段(左)或在片段内的链内二硫键的情况下彼此完全分开的抗体片段(右)。在这种情况下，由于缺乏蛋白的某些区段，在片段之间不存在强力非共价相互作用，并且因此在存在链内二硫键时该抗体片段彼此不缔合。这些片段可能对相同的靶标或对两种不同的靶标(双特异性)具有特异性。[0028]图2：生物过程的单元操作的示意图，其包含用于实施本发明的方法的多个时间点。方法的实施可以(1)在单元操作之内，如通过添加至生物反应器或纳入于色谱柱的清洗步骤中，(2)在单元操作之间，如在生物反应器和收获物容纳槽之间的转移过程中，或(3)在过程中间物如色谱洗脱液或生物收获物的维持步骤过程中。其它备选生物过程方案是可能的，包括在生物过程中纳入不同的或另外的单元操作。变化的实例包括其它澄清操作(除了离心和深度过滤)或纳入额外的色谱步骤。
[0029]图3描绘了含有细胞的(未澄清的收获物)维持研究(hold study)，其中维持时间、
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温度和初始活细胞密度(VCD)有所变化。半抗体含量占全部抗体分子的百分比随维持时间(天数)的函数显示于图3A和图3C。在图3A中，半抗体含量作为维持时间的函数在三个不同的温度测量：8℃/冷(圆圈)、21℃/室温(方形)或37℃/暖(三角)。在图3C中，作为维持时间的函数测量混合样品(圆圈)或未混合的低VCD样品(菱形)的半抗体含量。以百万细胞每mL(x106细胞每mL)计的活细胞密度作为维持时间(天数)的函数示于图3B和图3D。在图3B中，半抗体含量作为维持时间的函数在三个不同的温度测量：8℃/冷(圆圈)、21℃/室温(方形)或37℃/暖(三角)。在图3D中，作为维持时间的函数测量混合样品(圆圈)或未混合的低VCD样品(菱形)的半抗体含量。
[0030]图4描绘了在含有细胞的(未澄清的收获物)维持研究中混合对于IgG4半抗体的影响。在通过轻柔旋转混合(虚线圆圈)或无混合(实线圆圈)的条件下的半抗体含量占全部抗体分子的百分比作为维持时间(天数)的函数显示。将样品维持在8℃。两种条件下的初始细胞存活力均为大约2.5x106细胞/mL。
[0031]图5描绘了在含有细胞的(未澄清的收获物)维持研究中添加氧化还原试剂的影响。半抗体含量以全部抗体分子的百分比作为维持时间(天数)的函数作为无谷胱甘肽添加(圆圈)、添加5mM还原型谷胱甘肽(GSH)和0.5mM氧化型谷胱甘肽(GSSG，方形)或添加0.5mM GSH和5mM GSSG(三角)的函数显示。将样品在8℃维持指定的时间。全部三种条件的初始细胞存活力均为大约2.5x106细胞/mL。
[0032]图6描绘了在高pH(7.1)和低pH(6.9)两个设定点处、在接近其运行终点处向生物反应器添加0.5mM 2-MEA、2mM 2-MEA和5mM还原性谷胱甘肽(GSH)氧化还原试剂的效果。在pH 7.1(空心方形)或pH 6.9(实心方形)添加2mM2-MEA、在pH 7.1(空心圆形)或pH 6.9(实心圆形)添加0.5mM 2-MEA或添加5mM还原型谷胱甘肽(GSH)(实心菱形)的条件下，半抗体含量以全部抗体分子的百分比作为维持时间(天数)的函数显示。空心方形和实心方形的数据系列接近彼此重叠。
[0033]图7描绘了两种不同的初始细胞存活力对用2-MEA处理的半抗体比例的影响。半抗体含量以全部抗体分子的百分比作为处理后维持时间(小时)的函数显示。从生物反应器获取样品，将生物反应器控制的各个参数控制在指定水平。研究的两种不同的初始存活力是在补料分批培养第12天(D12)的70％存活力(圆圈)和在补料分批培养第14天(D14)的45％存活力(方形)。
[0034]图8描绘了温度和pH条件对获取自先前用2-MEA处理的生物反应器的澄清的收获物的影响。半抗体含量以总抗体分子的百分比作为维持时间(小时)的函数，作为以少于0.1的pH增加(实心菱形)或大于0.5的pH增加(空心菱形)在2-8℃维持，或作为以少于0.1的pH增加(实心三角)或大于0.5的pH增加(空心三角)在室温(21℃)维持的函数显示。
[0035]图9描绘了在室温(21℃)或8℃温育维持后2-MEA处理对在澄清的收获材料中半抗体比例的影响。图9描绘了每种样品在用或不用2-MEA处理的条件下在最初两个小时的半抗体比例。测试条件包括室温(21℃)不添加2-MEA(圆圈)、室温(21℃)添加2-MEA(菱形)、8℃不添加2-MEA(方形)、8℃添加2-MEA(三角)。
[0036]图10描绘了在室温(21℃)或8℃温育维持后2-MEA处理对在澄清的收获材料中半抗体比例的影响。图10描绘了各样品在7天(168小时)中使用或不使用2-MEA处理的条件下半抗体的比例。试验条件包括：室温(21℃)不添加2-MEA(圆圈)，室温(21℃)添加2-MEA(菱
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形)，8℃不添加2-MEA(方形)，和8℃添加2-MEA(三角)。
[0037]图11描绘了用于评价多种氧化还原试剂控制生物过程中存在的半抗体比例的能力的非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果。将氧化还原试剂加入蛋白A洗脱液并在pH4.8于室温温育2小时。在蛋白A柱上将所有样品再次纯化以除去任何存在的氧化还原试剂。测试条件包括无氧化还原试剂(泳道1)，2mM 2-MEA(泳道2)，3mM 2-MEA(泳道3)，2mM MEA+2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)(泳道4)，2mM还原型谷胱甘肽(GSH)(泳道5)2mM GSH+2mM GSSG(泳道6)，2mM巯基乙醇(泳道7)，和2mM二硫苏糖醇(泳道8)。
[0038]图12描绘了分析IgG4抗体的非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图像。在变性的条件下，如在SDS-PAGE上，半抗体表现为与完全抗体分开的不同条带。泳道1：分子量标记，泳道10：用半抗体控制方法处理前的IgG4测试样品，泳道11：用设计来减少总半抗体的半抗体控制方法处理的IgG4测试样品。[0039]发明详述
[0040]本发明包括控制由生物过程产生的蛋白的多肽之间二硫键形成的方法。测量多肽之间二硫键形成(例如数目)的一个方法是测量存在于包含抗体分子群体的溶液中半抗体(Hab)分子的比例。通过测量调理的溶液对免疫球蛋白G亚类4(IgG4)抗体溶液中存在的半抗体浓度的影响，测量调理的溶液对多肽之间二硫键形成的影响。如本文所公开的，含多肽的溶液的某些参数对多肽之间二硫键的形成具有预料不到的并且强力的影响。公开了了许多方法以控制二硫键形成，包括降低、增加或维持多肽之间二硫键形成的程度的策略。如本文中详细公开的，这些方法可应用在用于蛋白生产的典型生物过程内的多个点，所述蛋白生产包括例如抗体蛋白或抗体片段的生产。(图2)。[0041]IgG4具有一些特性，使它们成为有吸引力的治疗候选物以及用于测量多肽之间的二硫键形成的优越模型。例如，IgG4具有长血清半衰期和低Fc功能和/或效应功能。(Bruggemann等，1987，J Exp.Med.166(5):1351-61)。然而，IgG4抗体也有不同寻常的性质，其在体内是不理想的：IgG4抗体是不稳定的、动态的分子，其参与Fab臂交换(Fab arm exchange)。施用的治疗性IgG4抗体可能与具有不理想的特征的内源IgG4抗体进行交换。该过程的随机性引入了不可预测性，这对于人用免疫治疗非常不理想。
[0042]这些围绕IgG4的Fab臂交换作用和半抗体的体内效果的不确定性使得人们期望将最终治疗性抗体组合物中存在的半抗体程度最小化。此前，通过将IgG4抗体铰链区的氨基酸序列突变为IgG1铰链区的氨基酸序列来降低Hab比例，这已被证明显著地稳定了IgG4重链之间的共价二硫键相互作用(Angal等,1993,Mol.Immunol.30(1):105-8；Schuurman等,2001；美国专利申请公开No.US 2011/0086366 A1)。改变氨基酸序列和所产生的抗体的蛋白结构，特别是对于已处于积极的临床研究中的治疗性抗体，提出了科学和监管两方面的挑战。结果是，这种诱变策略在许多情况下无法应用，在这些情况下使用具有一定水平的半抗体的治疗性IgG4的临床和甚至临床前经验是很重要的。因此，必须建立控制半抗体浓度程度的策略以确保整个后续的对治疗性IgG4分子的临床研究和商品化的分子一致性。[0043]本发明的方法包括用于控制由生物过程产生的多聚体蛋白的多肽之间二硫键形成的多种方法。本发明的方法包括应用调理的溶液的含细胞的和无细胞的方法，所述调理的溶液包含预定的溶液参数、包括氧化还原试剂本体、氧化还原试剂浓度、pH、气体本体、溶解的气体水平、电导率和/或活细胞密度。这些方法可以在生物过程内的一个或多个点实施
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以控制、降低、增加或维持多聚体蛋白的多肽之间的二硫键形成，如例如IgG4抗体的重链之间的二硫键形成。多肽单体和/或多聚体之间二硫键的形成的控制对于实现多聚体蛋白产品的生命周期内产品质量的一致性或在生产多聚体蛋白的生物等效版本或生物相似版本时是必需的。[0044]调理的溶液[0045]在一个方面，本文呈现的方法公开了将蛋白的多肽与“调理的溶液”接触，所述“调理的溶液”已经过优化以产生理想的多肽之间二硫键的形成或数目。这种调理的溶液已经预先确定以控制所需二硫键的形成。在一些实施方案中，调理的溶液已经预先确定以减少蛋白的多肽之间二硫键的数目。在其它实施方案中，该调理的溶液已经预先确定以增加蛋白的多肽之间二硫键的数目。在其它实施方案中，调理的溶液已经预先确定以维持蛋白的多肽之间二硫键的数目。温育条件和预定的条件参数对二硫键形成的影响可以通过测量蛋白溶液中存在的IgG4半抗体的比例来证明。在本发明的一些实施方案中，确定包含多聚体蛋白的溶液中半抗体分子(Hab)的比例。半抗体分子的比例的确定可以用作测量多聚体蛋白的多肽之间的二硫键形成的方法。[0046]如根据本发明的方法所用的，“调理的溶液”包括一个或多个预定的溶液参数。在一些实施方案中，在将本发明的方法应用于产生蛋白的生物过程之前，在将该方法应用于用来产生目的蛋白的生物过程之前，确定调理的溶液的参数。在该方法的一个方面，所述调理的溶液是含有细胞的。在另一个方面，所述调理的溶液是无细胞的。关于这些方面中每一个的其它细节公开于本说明书的别处(见下文)。
[0047]对二硫键的形成或数目的控制可以受到选择用于实施该方法的具体多肽、蛋白和/或蛋白类别的特性的影响。对二硫键的形成的控制也可受到用于产生目的蛋白的生物过程的特性的影响，包括例如生物过程的设计和包括该生物过程的单元操作的特性。因此，可能有必要进行初步测试研究以优化一种或多种调理的溶液参数来实现使用所选择的蛋白和生物过程时期望的结果。此类测试研究和实验的非性实例在本文公开(参见“实施例”部分，下文)
[0048]本文公开的不同的预定溶液条件可地或与其它预定溶液条件组合应用。对于示例性研究，参见表2(下文)。每一种本文所公开的条件根据本发明的方法对蛋白多肽之间的二硫键形成提供了一定水平的控制。一种预定的溶液条件可能会影响任意给定溶液中的一种或多种其它预定的溶液条件。在一些情况中，一些预定的溶液条件会与一种或多种其它预定的溶液条件“互补”，这允许使用较少的极端条件以产生所期望的二硫键形成结果。例如，在溶液中使用具体的气体和气压(例如氧气)可能需要降低的氧化还原试剂浓度以实现与不使用该具体气体的溶液相同的结果。在一些实施方案中，预定溶液条件的组合应用对二硫键的形成产生累加效果。在其它实施方案中，预定溶液条件的组合应用产生对二硫键的形成产生协同效果。[0049]如本文所使用的，术语“预定的溶液参数”是指溶液的一个或多个参数、特性、性质、组成、含量和/或其它属性。
[0050]在本发明的方法的一些应用中，Hab分子在溶液中的比例是所期望的二硫键形成结果。一方面，将本发明的方法用于控制包含抗体分子群体的溶液中半抗体分子的比例。在这些应用中，将本发明的方法用于控制Hab形成中涉及的二硫键。该方法能够产生具有期望
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比例的Hab分子的调理的抗体溶液。[0051]在一些实施方案中，选择Hab分子在溶液中所期望的比例作为绝对量或绝对量的范围。通过使用本发明的方法，能够以期望的绝对量或Hab的比例为目标来控制溶液中Hab分子的比例。可能使用本发明的方法来提高或降低Hab的比例。在一些实施方案中，Hab分子在溶液中的期望比例小于5％、约5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-50％，或大于50％。
[0052]在其它实施方案中，选择Hab分子在溶液中的期望比例作为与应用本发明的方法之前的溶液相比的百分比变化或百分比变化的范围(如百分比增加或减少)。通过使用本发明的方法，能够以Hab比例的期望百分比变化为目标来控制Hab分子在溶液中的比例。[0053]在一些实施方案中，溶液中Hab分子比例的期望的变化是减少约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、50％，或更多。在一些其它实施方案中，溶液中Hab分子比例的期望的变化是减少约1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-50％，或超过50％。在其它实施方案中，溶液中Hab分子比例的期望的变化是减少约1-50％。[0054]在其它实施方案中，溶液中Hab分子比例的期望的变化是增加约1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、50％，或更多。在一些其它实施方案中，溶液中Hab分子比例的期望的变化是增加约1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-50％，或大于50％。在其它实施方案中，溶液中Hab分子比例的期望的变化是增加约1-50％。[0055]氧化还原试剂
[0056]在本发明的方法的一个方面，预定的溶液参数是调理的溶液中使用的氧化还原试剂的本体。如本文所用，术语“氧化还原试剂”是指以混合物形式含有其还原形式、其氧化形式或其还原形式及其氧化形式的组合的试剂。根据本发明的方法，氧化还原试剂可以取决于对具体蛋白和/或生物过程所期望的二硫键形成结果而存在或不存在于调理的溶液中。在调理的溶液中存在氧化还原试剂的实施方案中，鉴定出特定的氧化还原试剂用于纳入调理的溶液中。
[0057]适合于本发明的方法的氧化还原试剂的非性实例包括2-巯基乙胺(2-MEA)、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺和亚硫酸钠。取决于具体的蛋白和/或溶液，一些氧化还原试剂可产生优越的结果。普通技术人员能够针对具体的蛋白溶液鉴定、选择和测试不同的氧化还原试剂，以确定根据本发明的方法使用哪种氧化还原试剂。(参见例如美国专利申请公开No.US 20130259882 A1)。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的氧化还原试剂是巯基乙胺(2-MEA)。已证明2-MEA特异性减少IgG4的铰链区二硫键。(Palmer等,1963,J Biol.Chem.,238(7):2393-2398)。
[0058]氧化还原试剂的使用已在抗体领域由于不同的目的而得到了研究。例如，氧化还原试剂如2-巯基乙胺(2-MEA)已经被用于特异性减少两个Fab臂之间的链间二硫键，以促进Fab臂交换。(King等,1992,Biochem J.281(2):317-23)。[0059]在本发明的方法的一些实施方案中，一种预定的溶液参数是调理的溶液中氧化还原试剂的浓度。可根据本发明的方法使用一定浓度范围的所选的(多种)氧化还原试剂。一旦选择了某种氧化还原试剂，该氧化还原试剂的浓度必须根据所选择的氧化还原试剂、蛋白和/或生物过程进行优化。在调理的溶液中存在氧化还原试剂的方法的一些实施方案中，
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调理的溶液中较低浓度的氧化还原试剂会导致蛋白多肽之间二硫键形成的增加。例如，在一个实验中，调理的溶液中较低浓度的氧化还原试剂的使用导致半抗体分子在溶液中抗体分子群体中的比例降低(表2)。
[0060]在调理的溶液中存在氧化还原试剂的方法的其它实施方案中，调理的溶液中较高浓度的氧化还原试剂会导致蛋白多肽之间二硫键的形成或数目的减少。例如，在一个实验中，调理的溶液中较高浓度的氧化还原试剂的使用导致半抗体分子在溶液中抗体分子群体中的比例增加。(表2)。
[0061]在一些实施方案中，氧化还原试剂的最佳浓度包括0.01、0.1、0.5、1、2、5、25、50mM或更高。
[0062]氧化还原试剂的最佳浓度也可能受到溶液中蛋白或多肽浓度的影响。因此，在一些实施方案中，可在确定调理的溶液中的最佳氧化还原试剂参数时评估氧化还原试剂浓度与蛋白浓度的比例。除了确定调理的溶液的氧化还原试剂浓度之外，或作为选择地，可确定氧化还原试剂浓度与蛋白浓度的比例。[0063]在一些实施方案中，氧化还原试剂摩尔浓度与蛋白摩尔浓度的最佳比例包括至少2:1、4:1、8:1、16:1、32:1、:1、72:1、88:1、100:1或更高。在所述方法的一些实施方案中，如某些无细胞蛋白溶液，氧化还原试剂摩尔浓度与蛋白摩尔浓度的比例包括约4:1至约40:1。
[00]温育时间
[0065]在本发明的方法的另一个方面，将调理的溶液与多聚体蛋白的多肽一起温育预定的时间。如在本发明的方法的其它方面所见，预定的温育时间可能受到选用于应用该方法的蛋白、生物过程和/或其它溶液条件的特性的影响。取决于调理的溶液的预定溶液参数，温育时间可以是短如1分钟或更短，或超过一周或更长。例如，如果氧化还原试剂在调理的溶液中的浓度高时，温育时间可能必须更短，以避免损害蛋白。反之，如果氧化还原试剂的浓度低，温育时间可能必须更长，以实现对二硫键的期望的控制。作为另一说明性实例，如果将蛋白在具体的pH温育较长的时间周期可能导致蛋白的不稳定性，则同一蛋白在相同的具体pH值处如果只温育很短的持续时间则可能维持稳定。因此，如果相应调整温育时间以尽可能减少蛋白的不稳定性的话，可对一些蛋白应用更极端的pH值。此类测试研究和实验的其它非性实例公开于实施例2和图3中。[0066]温育温度
[0067]在本发明的方法的另一个方面，将调理的溶液与多肽一起在预定的温度温育。如在本发明的方法的其它方面所见，预定的温育温度可能受到选用于应用该方法的蛋白、生物过程和/或其它溶液条件的特性的影响。此外，不同的蛋白在具体的温度包含不同的稳定性。例如，所期望的结果可能取决于温育温度而更快或更慢发生。在一些实施方案中，可以降低温度从而促进二硫键形成和半抗体向完全抗体的转化。在其它实施方案中，可以提高温度以促进完全抗体向半抗体的转化。此类测试研究和实验的另其他非性实例公开于实施例4和图3中。
[0068]在本发明的方法的一些实施方案中，将调理的溶液与多肽在约2℃至约40℃的预定温度进行温育。[0069]pH
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在本发明的方法的另一个方面，调理的溶液中的一种预定的溶液参数是调理的溶
液的pH值。如在本发明的方法的其它方面所见，调理的溶液的最佳pH可能受到选用于应用该方法的蛋白、生物过程和/或其它溶液条件的特性的影响。此外，也可以优化该蛋白在具体pH值处温育的时间周期。调理的溶液的pH通常根据与调理的溶液温育后得到的含有多肽的溶液所需的pH来确定。在一些实施方案中，pH值未经调整，并使其维持在大约中性的pH(例如6至8)。在一些其它实施方案中，将含有多肽的溶液的pH调整到约4.0至约4.8。在其它实施方案中，将含有多肽的溶液的pH调整到约3.0至4.0。在其它实施方案中，将含有多肽的溶液的pH调整至到约2.5至4.8。在其它实施方案中，将含有多肽的溶液的pH调整到约2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7或约4.8。在一些其它实施方案中，将含有多肽的溶液的pH调整到约2.5或更低。在其它实施方案中，将含有多肽的溶液的pH调整到约4.8或更高。此类测试研究和实验的另外的非性实例公开于实施例10和表3中。[0071]气体本体和溶解的气体水平[0072]在所述方法的另一方面，一种预定的溶液参数是添加至调理的溶液的气体本体。根据本发明的方法，取决于对于具体蛋白和/或生物过程所期望的二硫键形成，气体可以存在或不存在于该调理的溶液中。在调理的溶液中存在气体的实施方案中，选择一种或多种具体气体纳入该调理的溶液中。可选择的气体的实例是氧气(O2)、二氧化碳(CO2)、氮气(N)，以及混合气体的不同组合物，如20％O2/10％CO2/70％空气或20％O25％CO2/75％空气。[0073]在本发明的方法的一些调理的溶液中存在气体的实施方案中，另一预定的溶液参数是调理的溶液中溶解的气体水平。根据本发明的方法，可以使用选择的一种或多种气体的某个范围的溶解气体水平。一旦选择了气体，则必须根据所选择的气体、蛋白和/或生物过程对气体浓度进行优化。[0074]电导率
[0075]在所述方法的另一方面，一种预定的溶液参数是调理的溶液的电导率。根据本发明的方法，取决于对具体蛋白和/或生物过程所需的二硫键形成结果，可将电导率设定至期望的水平。电导率可以通过添加盐来控制，所述盐如氯化钠、氯化钾、硫酸铵、磷酸钠或本领域中已知的改变溶液电导率的其它化学物质。另外，根据其通常的电导率，可以选择生物过程中的某些阶段作为半抗体控制点。例如，通常以生理电导率(10-15mS/cm)进行细胞培养过程，而离子交换加载材料通常是低电导率的(<10mS/cm)。[0076]活细胞密度
[0077]在所述方法的另一方面，一种预定的溶液参数是调理的溶液中的活细胞密度。在一些实施方案中，生物反应器单元操作在具体的一天在已经与指定的活细胞密度匹配的生物反应器运转中终止。根据本发明的方法，取决于对具体蛋白和/或生物过程所需的二硫键形成结果，调理的溶液中可存在或不存在活细胞。在一些实施方案中，活细胞密度为至少约2×106细胞/mL。
[0078]含有细胞的方法[0079]在一个方面，本发明的方法可以在生物过程中当蛋白或多肽处于包含多个细胞的溶液(也称为“含有细胞的溶液”、“含有细胞的悬浮液”或“未澄清的收获物”)中的时间点处应用。对于蛋白生产中常用的生物过程，在所述生物过程中的特定时间点处，目的蛋白存在
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于包含多个细胞的溶液中。在这些时间点处，该蛋白可存在于数个可能的生物过程位置，包括例如生物反应器、容纳槽或包含多个细胞的非生物反应器单元操作容器。未澄清的收获物可从如补料分批、分批或灌注(连续)工艺等这些生物反应器工艺获得。在一些实施方案中，该方法可应用于与生物反应器分开的容器中。在其它实施方案中，所述方法可在专门设计来使用具体调理的溶液实现所需的二硫键形成的单元操作容器中应用。例如，可设计该单元操作容器以实现在具体条件下所期望的半抗体向完全抗体的转化。这些单独的容器的非性实例包括管式反应器、连续搅拌釜反应器(CSTR)，和循环回路(circulation loop)。有关这些生物过程位置的其它信息提供于说明书中的别处。
[0080]在目的蛋白存在于包含多个细胞的溶液中的方法的一些实施方案中，将蛋白与调理的溶液接触，所述调理的溶液包含活细胞的群体。在这些实施方案的一些中，调理的溶液可以是包含该蛋白和多个细胞的相同溶液。例如，如果将本发明的方法应用到存在于生物反应器中的蛋白，则所述生物反应器中的溶液(例如培养基)视为是调理的溶液，其包含活细胞。如此，在这种说明性的实例中，预定的溶液参数会对应于已含有目的蛋白的溶液的参数。在其它此类实施方案中，该方法包括将蛋白与获取自生物过程的调理的溶液，例如在补料分批或分批生物反应器运转结束时获得的包含活细胞的溶液一起温育。在一些实施方案中，将本发明的方法应用于补料分批或分批生物反应器运转结束时和蛋白生产生物过程的澄清或捕获步骤之前。然而，取决于具体的蛋白、生物过程和所期望的二硫键形成的结果，可在蛋白生产生物过程的几乎任何阶段实施“维持”步骤，这取决于多种考虑，如实现二硫键形成的结果所需的时间、试剂成本和/或实施的简便性。[0081]在一些实施方案中，本发明的方法包括这样的步骤，其中使包含蛋白的含有细胞的溶液经历具体的预定时间的“维持”。这种“维持”步骤在典型的蛋白生产生物过程中是一种非常规的步骤。如实施例中所阐述的，取决于测试条件和调理的溶液参数，在细胞存在下维持生物治疗性IgG4抗体能够令人惊讶地减少、增加或大致维持抗体群体中存在的半抗体的比例(参见例如图3和实施例1至7)。因此，通过将包含活细胞的调理的溶液与多肽一起温育预定的时间，能够控制多肽之间的二硫键形成。[0082]在一些实施方案中，在“维持”步骤中不使用受控的补料(controlled feeding)。在另一实施方案中，为了更加精简的过程，生物反应器本身可作为维持容器使用，并且可关闭意在维持细胞存活力的典型生物反应器控制或补料。如果维持步骤在生物反应器中进行，在温育维持时间内，受控的补料可继续进行、改变或中止。在一些实施方案中，所述方法的“维持”步骤过程中的条件不像生物反应器中那样受到严格地监测和调整。例如，在一些此类实施方案中，“维持”抗体样品的氧气水平和pH参数仅以设计来维持或控制细胞存活力或生产率的方式来最低限度地监测和调整，或不监测和调整。[0083]在其它实施方案中，对所述方法的“维持”步骤过程中的条件进行积极的监测和调整。例如，在一些此类实施方案中，“维持”抗体样品的氧气水平和pH参数受到积极和严密的监测和调整。在维持步骤过程中对调理的溶液的积极监测和调整可发生在维持步骤的整个持续过程中、在维持步骤的部分持续过程中，或不在维持步骤的持续过程中。在维持步骤过程中可应用对调理的溶液的积极监测和调整，以确保在抗体样品上所期望的结果的再现性，即使这种积极的监测和调整可能对于实现所需的二硫键形成的结果而言不是必需的。如本文所公开的，这种包括维持步骤的方法已于各种规模、采用各种条件、溶液和配置得到
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了证明。维持含有多聚体蛋白的溶液的单元操作(例如本发明的方法的“维持”步骤)可以使用至少一个贮存器来进行。贮存器的体积可在较宽的范围变化，其取决于生产该蛋白所使用的生物过程。例如，可用于实现这种单元操作的贮存器可具有约1mL至约20,000L的体积，如在商业生产生物过程中的。在一些生产设计实施方案中，贮存器能够将含有该抗体的流体容纳一段宽范围的时间段，其范围从约1分钟直至3周或更长的时间。贮存器可同时用于容纳和冷藏(例如在低于25℃、低于15℃或低于10℃的温度)或容纳和加热(例如在高于25℃、高于30℃或高于35℃的温度)含有抗体的溶液。贮存器可具有任何形状，包括圆形圆柱体、椭圆形圆柱体或大致上为长方形的密封且非渗透性的袋。[0084]已经显示，在未澄清的收获物维持中的不同温育条件导致了不同的结果。在一个方面，对于含有细胞的蛋白溶液而言最重要的预调理的溶液(preconditioned solution)包括维持时间、维持温度、收获时的细胞存活力(通过收获日控制)和搅拌(参见图3-4)。在一个示例性实施方案中，可收集含有细胞的(未澄清的)收获物并冷却至8℃持续10天或更长时间，然后是在澄清和捕获下游步骤中的后续加工。[0085]此外，如以上文所述，本文提供的方法公开了向含有细胞的蛋白溶液添加氧化还原试剂从而加速多肽之间的二硫键形成。例如，如通过半抗体向完全抗体的转化所观察到的，包含氧化还原试剂的含有细胞的蛋白溶液可以比不含氧化还原试剂的未澄清的收获样品更快的速率和更大的程度降低Hab的比例(图5)。在一个实施方案中，为了降低半抗体的水平，可将氧化还原试剂的混合剂(cocktail)，例如0.5mN还原型谷胱甘肽和5mM氧化型谷胱甘肽，添加到含有细胞的收获物，持续数天而非数周，再进行后续的下游加工。[0086]无细胞的方法[0087]在另一方面，本发明的方法可以在生物过程、生物过程步骤或单元操作中多肽处于“无细胞”溶液中的时间点处应用。这些无细胞溶液包含目的蛋白，但基本上没有细胞存在于该溶液中。这些无细胞溶液中较低水平的异质性和复杂性对于应用的本发明的方法是有利的。在一些实施方案中，无细胞溶液包括蛋白A洗脱液。在其它实施方案中，无细胞溶液包括澄清的收获物。其它溶液、缓冲剂和/或洗脱液可用于根据本文描述的方法中的无细胞溶液中。
[0088]对于蛋白生产中使用的典型生物过程，目的蛋白存在于生物过程、生物过程步骤或单元操作某些时间点的“无细胞”溶液中。在一些示例性实施方案中，本发明的方法应用于病毒灭活、调整、色谱、过滤、稀释、浓缩或任何其它无细胞的生物过程步骤过程中的时间点。(图2)。生物过程(其中蛋白溶液可以是无细胞的)中的步骤的其它非性实例包括但不限于，澄清的收获物、捕获洗脱液、中间色谱过程的中间物或精修色谱过程的中间物。(图2)。在整个生物过程中有许多应用本发明的方法的机会，其通常包括其中溶液相的条件得到积极操作的步骤，包括例如当降低pH以实现病毒灭活或当在色谱柱操作之前或之后调整pH或电导率时。在一些实施方案中，本发明的方法会应用于澄清的收获物阶段。在一些其它实施方案中，本发明的方法会应用于捕获洗脱液阶段。在一些实施方案中，所述无细胞溶液是捕获后溶液。
[00]如本文所公开的，应首先针对具体的目的蛋白来确定用于无细胞溶液方法的最佳温育条件和预定的条件参数。温育条件和预定的条件参数对二硫键形成的影响可通过测量存在于蛋白溶液中的半抗体(例如IgG4半抗体)的比例来证明。在一些实施方案中，可向无
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细胞溶液添加氧化还原试剂，如过程中间物，以迅速提高多聚体蛋白的多肽之间的二硫键形成。使用本发明的方法，通过测量无细胞的蛋白溶液中IgG4半抗体的比例，多肽之间的二硫键能够有效地通过以指定浓度添加某些氧化还原试剂来控制，所述氧化还原试剂包括例如2-MEA。例如，进行了研究以优化温育条件和预定的条件参数以减少半抗体，所述研究评估示例性条件如pH、时间、温度、氧化还原试剂的浓度和IgG4抗体的浓度。参见例如实施例9至15。在一个这样的示例性研究中，当将包含IgG4抗体的澄清的收获物与氧化还原试剂2-巯基乙胺(2-MEA)一起在2-8℃温育并在蛋白A柱上纯化以去除氧化还原试剂时，Hab的比例在1小时内从约18％降低至约9％，并在一定条件下，在短至10分钟内。(参见例如图9)。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的氧化还原试剂是2-MEA。已显示2-MEA是用于降低测试的示例性抗体溶液中Hab含量最有效的氧化还原试剂。在一些实施方案中，无细胞溶液中的多肽之间二硫键的形成高度依赖于调理的溶液的pH。[0090]定义
[0091]如本文所用的，在名词前的词语“一个/一种”表示一个或多个/一种或多种该具体名词。例如，短语“抗体”表示“一种或多种抗体”。[0092]如本文使用的术语“抗体”泛指任何免疫球蛋白(Ig)分子，其由四条多肽链组成(两条重(H)链和两条轻(L)链)，或其任何功能性突变体、变体或衍生物，它们保留了免疫球蛋白(Ig)分子的基本表位结合特征。在大多数的抗体中，每条重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，即CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，其称为互补决定区(CDR)，穿插以更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。抗体还可以是双特异性抗体、三特异性抗体、二聚体抗体、三聚体抗体或多聚体抗体。(参见例如美国专利申请公开No.US20120251541A1)。[0093]本文所用的术语“抗体片段”是指完全抗体的一部分，并且通常是一条保留了Ig分子的基本表位结合特征的多肽链(或是重(H)链或是轻(L)链)，或其任何功能性突变体、变体或衍生物。抗体片段的实例包括但不限于，Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，功能性重链片段，功能性轻链片段，亲和抗体
和纳米抗体
[0094]“人源化抗体”是源自非人类物种的抗体，其中在重链和轻链的框架和恒定域的某
些氨基酸经过突变，从而避免或消除在人中的免疫应答。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。对于大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基由来自非人物种(供体抗体)的高变区的残基替换，所述非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类，其具有期望的特异性、亲和力和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。在一般情况下，人源化抗体会包含基本上全部的至少一个通常为两个可变域，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，而全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体通常还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的那部分。更多详情参见Jones等,1986,Nature 321:522-525；
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Riechmann等,1988,Nature 332:323-329；Presta等,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。
[0095]治疗性抗体的非性实例包括：帕尼单抗(panitumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿托续单抗(actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、阿珠单抗(alacizumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿表妥昔单抗(amatuximab)、马安莫单抗(anatumomab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿替奴单抗(atinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、巴利昔单抗(basilizimab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、比西单抗(biciromab)、卡那单抗(canakinumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达克珠单抗(daclizumab)、迪诺赛单抗(densumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、达珠单抗(etaracizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木单抗(golimumab)、英利昔单抗(infliximab)、那他珠单抗(natalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)、和曲妥珠单抗(trastuzumab)。[0096]本文所用的术语“非抗体蛋白”是任何无法通过以下任何一种免疫球蛋白特异性亲和力相互作用而被结合的蛋白：蛋白A结合至Fc区，蛋白G结合至Fab区，蛋白G结合至Fc区，或蛋白L结合至免疫球蛋白轻链。在一些实施方案中，非抗体蛋白是生物治疗性蛋白。生物治疗性蛋白可为例如工程化的蛋白、酶、激素、血液因子、生长因子或免疫因子。术语“非抗体蛋白”可指生物过程的任何阶段的蛋白产物，包括纯化阶段之前、期间或之后。非抗体蛋白是纯化和/或分离自包含非抗体蛋白和其它组分的非均相溶液的重组蛋白。这类组分的实例是存在于液体培养基中或来自宿主细胞(例如来自哺乳动物、酵母或细菌宿主细胞)的污染性蛋白、脂质和核酸，以及其它生物污染物(例如病毒和细菌污染物)。[0097]术语“多聚体蛋白”在本文中定义为包括这样的蛋白，所述蛋白包含通过一个或多个二硫键而缔合或结合的一个或多个多肽。多聚体蛋白可以作为超过一个多肽单体亚基的复合体存在，其中每个单体亚基与一个或多个其它单体亚基通过一个或多个二硫键缔合。多聚体蛋白可包含两个或更多个相同的多肽链，而不含任何不同的多肽链(“同源多聚(homomultimeric)”)。“同源多聚体”由同一多肽链的两个或更多个拷贝组成。类似地，“同源二聚体”由同一多肽链的两个拷贝组成，“同源三聚体”由同一多肽链的三个拷贝组成，等等。或者，多聚体蛋白可以包含至少两种不同的多肽链。(“异源多聚(heteromultimeric)”)。如果异源多聚体具有三个或更多个多肽链，那么其中一些可以是彼此相同的，只要至少有一个与其它不同。术语“多聚体”涵盖指定了多聚体含有多少多肽链的术语如“二聚体”、“三聚体”或“四聚体”。抗体是多聚体蛋白的实例。抗体样多聚体蛋白的实例包括scFv、双抗体(diabody)和三体(tribody)或三抗体(triabody)分子，或Fc-融合蛋白的多聚体。可作为多聚体蛋白存在的非抗体蛋白的实例包括纤维蛋白原、载脂蛋白异源二聚体、血小板源生长因子、络丝蛋白(reelin)和猪颌下腺粘蛋白(porcine submaxillary mucin)。
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如本文所用的术语“多肽”意指具有至少或约4个氨基酸，至少或约5个氨基酸，至
少或约6个氨基酸，至少或约7个氨基酸，至少或约8个氨基酸，至少或约9个氨基酸，至少或约10个氨基酸，至少或约11个氨基酸，至少或大约12个氨基酸，至少或约13个氨基酸，至少或约14个氨基酸，至少或约15个氨基酸，至少或约16个氨基酸，至少或约17个氨基酸，至少或约18个氨基酸，至少或约19个氨基酸，或至少或约20个氨基酸的长度，或大于20个氨基酸的长度的多肽序列。本文所用的“多肽”的定义中包括蛋白的单聚体(例如单体)和多聚体形式(例如二聚体，三聚体等)。纤维蛋白原是六聚体蛋白的一个实例。多肽的其它实例包括重链和轻链抗体肽。[0099]术语“完全抗体”包括其中存在重链间二硫键的抗体，使得完全抗体在使用非还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它使用非还原性的变性溶液条件的分析技术时观察到组合的两条轻链多肽和两条重链多肽。(参见例如图11和图12)。[0100]术语“半抗体”包括其中不存在重链间二硫键的抗体(例如IgG4抗体)，使得半抗体使用非还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它使用非还原性的变性溶液条件的分析技术时观察到组合的单一轻链多肽和单一重链多肽。在非变性条件下，半抗体是难以检测的，原因是强力的链间非共价相互作用在没有链间二硫键存在的情况下仍然普遍存在。(Taylor等,2006,Anal Biochem.353(2):204-208)。半抗体示于图1A，而含半抗体的样品的非还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的结果包括在图12中。[0101]如本文所用的术语“半抗体转化”或“半抗体的转化”是指一种生化过程，通过该过程半抗体成为完全抗体，例如通过链间二硫键的形成或再形成。[0102]术语“活性”包括多种活性，例如抗体或半抗体对一个或多个抗原、靶标或配体的结合特异性和亲和力。[0103]术语“IgG4”包括在次级免疫应答过程中产生的和最常见于血液中的一个IgG免疫球蛋白子类。这些IgG抗体通常包含γ4重链。[0104]本发明的方法对IgG4抗体，特别是治疗性IgG4抗体提供了显著益处。可通过本文提供的方法来生产的IgG4抗体的非性实例包括那他珠单抗(natalizumab)(
Biogen Idec)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)(
Pfizer)和夫苏木单抗
(fresolimumab)(Genzyme)。针对α4β1(VLA-4)和α4β7整联蛋白的α4亚基的那他珠单抗和特
异性针对CD33的吉妥珠单抗是先前批准用于人用的两种人源化IgG4抗体。那他珠单抗是多发性硬化(MS)的有效治疗手段，而吉妥珠单抗与细胞毒性卡奇霉素衍生物(calicheamicin derivative)缀合用于治疗急性髓性白血病(AML)(Zohren等,2008,Blood 111:33-35)。对另一种基于人源化IgG4的治疗剂TGN1412(CD28特异性)的开发在引起了健康个体中的意外不良事件之后中断。那他珠单抗也与不良事件有关，特别是进行性多灶性脑白质病，一种JC多瘤病毒对中枢神经系统(CNS)的感染。[0105]术语“半分子交换”是指对于抗体(例如IgG4)的一类蛋白修饰，其中将抗体重链和所连接的轻链(半分子)与来自另一IgG4分子的重-轻链对互换。如此，抗体分子可获取识别两种不同抗原的两个不同的Fab臂(得到双特异性分子)，而它们的Fc域结构维持不变。(Labrijn等,2013,Proc Natl AcadSci USA.110(13):5145-50)。也可发生物种间的半分子交换，得到改变的Fc域结构，其同样包含来自两个物种供体中每一个的域。(Labrijn等,2009,Nature Biotechnol.27(8):767-771)。半分子交换也称为“Fab臂交换”。(Rispens等,
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2011,J Am Chem Soc.133(26):10302-10311)。[0106]术语“非还原性”指这样的条件，在该条件下二硫键(例如二硫连接(disulfide linkage))得以保留。具体而言，在该条件下二硫键维持完整，并且不转化为游离硫氢化合物(sulfhydrils)。[0107]术语“基本上不含”意指组合物(例如液体培养基)是至少或约90％不含(例如至少或约95％，96％、97％、98％，或至少或约99％不含，或约100％不含)指定物质的。[0108]术语“培养”或“细胞培养”意指在一组受控的物理条件下维持细胞或使细胞增殖。[0109]术语“连续过程/工艺/方法(continuous process)”意指连续实现或产生结果的过程(例如，从液体培养基中连续产生治疗性蛋白药物物质的过程)。例如，在系统处于操作中时连续地产生治疗性抗体药物物质(当然，算入抗体通过系统移动到出口时的初始迟滞期)。(大体上参见Shuler等,1992.Bioprocess engineering:basic concepts.New York:Prentice-Hall.)。一个示例性的连续生物制造系统描述于国际专利申请No.PCT/US2014/019909中。[0110]术语“半连续过程/工艺/方法(semi-continuous process)”意指大体上连续的用于纯化目标分子的过程，其中流体材料在任何单一工艺步骤的输入或输出是不连续的或间歇性的。例如，一个工艺步骤(例如一个结合和洗脱色谱步骤)中的输入可连续加载；然而，输出可间歇地进行收集，其中在纯化过程中的其它工艺步骤是连续的。因此，在一些实施方案中，本文描述的过程是“半连续的”，因为它们包括以间歇的方式操作的至少一个单元操作，而在该过程或系统中的其它单元操作可以连续的方式操作。[0111]术语“回收(recover)”或“回收(recovering)”意指为了(从液体培养基或稀释的液体培养基中存在的一种或多种其它成分(例如培养基蛋白或存在于或分泌自哺乳动物细胞的一种或多种其它成分(例如DNA、RNA或其它蛋白)))部分纯化或分离(例如，按重量计至少或约5％，例如，至少或约10％，15％，20％，25％，30％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或至少或约95％纯的蛋白)所进行的步骤。通常，使用结合蛋白的树脂进行捕获(例如通过使用亲和色谱法)。在本文中描述了用于从液体培养基中或稀释的液体培养基中捕获蛋白的非性方法，而其它方法是本领域已知的。蛋白可使用色谱柱或色谱膜从液体培养基回收(例如任何的本文所述的色谱柱或色谱膜)。[0112]术语“纯化”意指为了将抗体与存在于含有抗体的流体中的一种或多种其它成分(例如液体培养基蛋白或存在于或分泌自哺乳动物细胞的一种或多种其它成分(例如DNA、RNA或其它蛋白))分离而进行的步骤。例如，纯化可在初始捕获步骤之后进行。纯化可使用结合抗体的树脂来进行(例如，通过使用亲和色谱、阴离子或阳离子交换色谱或分子筛色谱)。抗体可使用色谱柱或色谱膜(例如任何本文中所描述的色谱柱或色谱膜)从含有蛋白的流体进行精修(polish)。[0113]术语“洗脱液”是工艺术语，并且意指从色谱柱或色谱膜放出的含有可检测量的抗体的流体。一个非性实例是蛋白A洗脱液。[0114]术语“过滤”意指从液体(例如本文所述的任何系统或过程中存在的液体培养基或流体)去除至少部分的(例如，至少80％，90％，95％，96％，97％，98％或99％)不合意的生物污染物(例如哺乳动物细胞、细菌、酵母细胞、病毒或分枝杆菌(mycobacteria))和/或颗粒状物质(例如沉淀的蛋白)。
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术语“澄清”意指从液体(例如液体培养基)去除细胞、细胞碎片和其它大的生物反
应器或细胞培养杂质。澄清蛋白样品的几种方法是本领域已知的。澄清方法的非性实例包括离心、微滤(microfiltration)、深层过滤(depth filtration)、无菌过滤、沉淀、絮凝和液-液萃取。澄清步骤完成之后立即获得的溶液通常被称为“澄清的收获物”。由于澄清过程，澄清的收获物是基本上无细胞的。[0116]术语“调整步骤”意指生物过程中的一个步骤，其中将含有多肽的一种流体与一种或多种其它流体组合以改变含有多肽的流体的参数，如氧化还原试剂浓度、pH、溶解的气体水平、电导率和/或活细胞密度。调整方法的非性实例包括添加低或高pH溶液以分别减少或增加pH，添加浓缩物以增加电导率或氧化还原试剂浓度，或向无细胞流体添加含有细胞的流体。流体添加的方法包括直接添加到维持容器，如罐或袋，或线内添加(inline addition)，其中在工艺流中将两种或更多种流体彼此组合。在一些实施方案中，使用缓冲液调整贮存器进行调整步骤。[0117]术语“灌注生物反应器”意指含有在第一液体培养基中的多个细胞的生物反应器，其中对存在于该生物反应器中的细胞的培养包括定期或连续去除该第一液体培养基，并在同一时间或稍后向该生物反应器添加基本上相同体积的第二液体培养基。在一些实例中，在培养期间在渐增的时间段(例如，约24小时的时间段，约1分钟至约24小时的时间段，或大于24小时的时间段)内在去除的第一液体培养基和添加的体积方面存在一种渐进的变化(例如，增加或减少)(例如以每天为基础的培养基重新进料速率)。每天去除和替换的培养基所占的分数可根据所培养的具体细胞、初始接种密度和具体时间处的细胞密度而变化。“RV”或“反应器容积”意指在培养过程开始时存在的培养基的体积(例如，接种后存在的培养基的总体积)。[0118]术语“补料分批生物反应器”是本领域的术语，并且意指含有在第一液体培养基中的多个细胞的生物反应器，其中对存在于该生物反应器中的细胞的培养包括定期或连续向第一液体培养基添加第二液体培养基，而无需实质性或显著地从细胞培养物去除该第一液体培养基或第二液体培养基。该第二液体培养基可与该第一液体培养基相同。在补料分批培养的一些实例中，该第二液体培养基是第一液体培养基的浓缩形式。在补料分批培养的一些实例中，该第二液体培养基作为干粉添加。[0119]如本文所用的术语“生物过程”，通常是指根据本发明的方法应用于蛋白的任何过程。在一些实施方案中，该生物过程是可在从液体培养基制造治疗性蛋白药物物质的过程中进行的一个或多个功能性步骤(“单元操作”)。典型的生物过程的一个实例示于图2。生物过程的非性实例包括过滤(例如，从含有抗体的流体去除污染物细菌、酵母、病毒或分枝杆菌，和/或颗粒状物质)、捕获、表位标签去除、纯化、维持或储存、精修、病毒灭活、调整含有抗体的流体的离子浓度和/或pH，和去除不需要的盐。在一些实施方案中，生物过程是生物反应器过程、种子培养(seed train)、捕获色谱、中间色谱、过滤、离心、沉淀、絮凝、UV照射和/或病毒灭活。在一些实施方案中，生物过程发生在生物反应器或色谱装置内。[0120]在一些实施方案中，术语“监测”指测量特定的过程参数或过程输出如产品质量属性(包括半抗体水平)、pH、溶解氧、培养基组分、生物过程单元操作和流速的能力。监测可根据实验或生物过程的具体设计来应用。例如，监测可应用在生物过程中的一个或多个特定的点、应用于生物过程中某些步骤或时间段或应用于生物过程的持续时间。
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在一些实施方案中，如本文所用的术语“控制”是指通过调整一种或多种温育条件
和/或预定的溶液参数来改变多聚体蛋白的多肽之间二硫键的形成或数目的能力。“控制”还指在生物过程的特定时间点的过程中增加、减少或维持多聚体蛋白的多肽之间二硫键的形成或数目的能力。在一些实施方案中，术语“控制”指在生物过程或单元操作的一个特定步骤或阶段中改变IgG4抗体中存在的半抗体的水平的能力。可进行调整的此类参数的非性实例包括时间、温度、pH、氧化还原试剂本体和浓度、气体本体、溶解气体水平、电导率和/或活细胞密度。[0122]如本文所用，术语“临界质量属性”，也称为“CQA”，意指应处于适当的限值、范围或分布中以确保所需产物质量的物理、化学、生物或微生物特性或特征。CQA的一个实例是多聚体蛋白的多肽之间二硫键的数目。CQA的另一个实例是抗体溶液中半抗体的比例。CQA的其它非性实例包括产品纯度、效力、荷电同种型概貌(charged isoform profile)、翻译后修饰、氧化、还原、脱酰胺化、加合物的形成、截短形式(clipped forms)、酶裂解、比活性、肽图谱、二聚体含量、产物聚集、位点特异性糖基化、总聚糖和/或糖基化概貌。为本发明的方法的具体应用选择适当的CQA和适当的测定法在本领域普通技术人员的能力范围之内。
[0123]在一些实施方案中，抗体的CQA通过测量来确定。在一些此类实施方案中，CQA使用高通量和/或快速的分析技术来测定。在一些实施方案中，CQA使用包括以下非性实例的分析技术来测定：高效液相色谱(HPLC)、差示折射法(differential refractometry)、荧光、超高效液相色谱(UPLC)、多角度激光光散射分析(MALLS)、质谱法、串联质谱法、等电聚焦、SDS-PAGE和/或差示扫描量热法。在其它实施方案中，高通量和/或快速分析技术由机器人进行。在进一步的实施方案中，所述机器人是液体处理机器人。[0124]色谱
[0125]本文所述的蛋白生产生物过程常常涉及使用一个或多个色谱柱。可以在色谱过程中采用一种或多种不同类型的缓冲液。如本领域已知的，用于本文所述的过程中的一种或多种类型的缓冲液取决于存在于色谱柱中的树脂或色谱柱的色谱膜、目的蛋白和单元操作。例如，可选择在本文所述任何过程中使用色谱柱期间采用的缓冲液的体积和类型，来优化一种或多种CQA或如下蛋白特性中的一种或多种：蛋白总的产率、蛋白的活性、抗体的纯度水平和生物污染物从含有蛋白的流体中的去除(例如，不存在活性病毒、分枝杆菌、酵母、细菌或哺乳动物细胞)。
[0126]可在当前描述的生物过程中执行的单元操作包括例如，澄清蛋白、捕获蛋白、灭活含有该蛋白的流体中存在的病毒、纯化蛋白、维持含有蛋白的流体、维持含有蛋白和细胞的流体、从含有蛋白的流体中过滤或去除颗粒状物质和/或细胞和调整含有蛋白的流体的离子浓度和/或pH。
[0127]可使用色谱柱或色谱树脂进行回收的单元操作，例如利用一个回收机构。回收机构的非性实例包括结合蛋白A的回收机构、结合蛋白或蛋白片段的回收机构、结合底物的回收机构、结合适配体的回收机构、结合标签的回收机构(例如基于聚组氨酸标签的回收机构)和结合辅因子的回收机构。捕获也可以使用可用于进行阳离子交换或阴离子交换色谱或分子筛色谱的树脂来进行。可用于回收蛋白的非性的树脂描述于本文中。
[0128]可使用含有树脂色谱柱或色谱膜(例如利用回收系统的)来进行纯化蛋白的单元
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操作。回收机制的非性实例包括结合蛋白A的回收机构、结合蛋白或蛋白片段的回收机构、结合底物的回收机构、结合适配体的回收机构、结合标签的回收机构(例如基于聚组氨酸标签的回收机构)和结合辅因子的回收机构。纯化也可以使用可用于进行阳离子交换或阴离子交换色谱或分子筛色谱的树脂来进行。可用于纯化蛋白的非性的树脂描述于本文中。
[0129]可使用过滤器或含有分子筛树脂的色谱柱或色谱膜来进行过滤含有蛋白的流体的单元操作。如本领域已知的，在本领域有各种各样的亚微米滤器(例如具有小于1μm、小于0.5μm、小于0.3μm、约0.2μm、小于0.2μm、小于100nm、小于80nm、小于60nm、小于40nm、小于20nm或小于10nm的孔尺寸的过滤器)可用，其能够去除任何沉淀的物质和/或细胞(例如沉淀的、展开的蛋白；沉淀的、不想要的宿主细胞蛋白；沉淀的脂质；细菌；酵母细胞；真菌细胞；分枝杆菌；和/或哺乳动物细胞)。已知具有约0.2μm或小于0.2μm的孔尺寸的过滤器有效地从含有蛋白的流体中去除细菌。含有分子筛树脂的色谱柱或色谱膜也可用于进行过滤含有蛋白的流体的单元操作。[0130]培养方法
[0131]本文中描述的一些方法进一步包括在包含液体培养基的生物反应器(例如，灌注或补料分批生物反应器)中培养产生多聚体蛋白或多聚体蛋白的多肽亚基的细胞的步骤，其中将一定体积或是含有细胞或是基本上不含细胞的该液体培养基连续地或周期性地从生物反应器中去除。该生物反应器可具有例如约1L至约10,000L的体积(例如约1L至约50L，约50L至约500L，约500L至约1000L，500L至约5000L，约500L至约10,000L，约5000L至约10,000L，约1L约10,000L，约1L至约8000L，约1L和约6000L，约1L至约5000L，约100L和约5000L，约10L至约100L，约10L至约4000L，约10L至约3000L，约10L和约2000L，或约10L至约1,000L)，或更多。存在于生物反应器的液体培养基的量可为例如约0.5L至约5000L(例如约0.5L至约25L，约25L至约250L，约250L至约500L，250L至约2500L，约250L至约5000L，约2500L至约5000L，约0.5L至约5,000L，约0.5L至约4,000L，约0.5L至约3,000L，约0.5L至约2,500L，约50L至约2500L，约5L至约50L，约5L至约2000L，约5L至约1500L，约5L至约1000L，或约5L至约500L)。例如，培养细胞可使用分批进料生物反应器或灌注生物反应器进行。培养细胞的非性实例和不同方面在下文描述，并且可以任意组合使用。[0132]细胞
[0133]在本文描述的一些方法中培养的细胞可以是细菌(例如革兰氏阴性细菌)、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或Arxula adeninivorans或哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是生长在悬浮液中的细胞或贴壁细胞。可在本文所述的任何方法中培养的哺乳细胞的非性实例包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO DG44细胞或CHO-K1s细胞)、SP2.0、骨髓瘤细胞(例如NS/0)、B细胞、杂交瘤细胞、T细胞、人胚胎肾(HEK)细胞(例如HEK 293E和HEK 293F)、非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)细胞和Madin-Darby犬(可卡猎犬(Cocker Spaniel))肾上皮细胞(MDCK)细胞。在一些培养贴壁细胞的实例中，培养也可包含多个微载体(例如含有一个或多个孔的微载体)。可在本文所述的任何方法中培养的其它哺乳动物细胞是本领域已知的。
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哺乳动物细胞可含有编码蛋白的重组核酸(例如稳定整合至哺乳动物细胞的基因
组中的核酸)。编码示例性抗体的重组核酸的非性实例在下文描述，正如可使用本文描述的方法产生的抗体。在一些情况下，在生物反应器(例如本文所述的任何生物反应器)中培养的哺乳动物细胞来源于更大的培养。
[0135]可将编码蛋白的核酸使用各种各样的分子生物学和分子遗传学中已知的方法引入哺乳动物细胞。非性实例包括转染(例如脂质转染))、转导(例如慢病毒、腺病毒或逆转录病毒感染)和电穿孔。在一些情况下，编码蛋白的核酸没有稳定地整合到哺乳动物细胞的染色体中(瞬时转染)，而在其它情况中核酸得到了整合。作为选择地或此外，编码蛋白的核酸可存在于质粒和/或哺乳动物人工染色体(例如人的人工染色体)中。作为选择地或此外，可将核酸使用病毒载体(例如慢病毒、逆转录病毒或腺病毒载体)引入到细胞中。核酸可与启动子序列(例如强启动子，如β-肌动蛋白启动子和CMV启动子，或诱导型启动子)可操作地连接。如果需要的话，含有核酸的载体可还含有选择性标记(例如，为哺乳动物细胞赋予潮霉素、嘌呤霉素或新霉素抗性的基因)。[0136]在一些情况下，所述蛋白是分泌蛋白，并由哺乳动物细胞释放至胞外培养基中(例如第一和/或第二液体培养基)。例如，编码可溶性蛋白的核酸序列可含有编码位于蛋白的N-或C-末端的分泌信号肽的序列，其由存在于哺乳动物细胞中的酶裂解，并且随后释放到胞外培养基(例如第一和/或第二液体培养基)中。[0137]培养基
[0138]液体培养基(例如第一和/或第二组织培养基)可以补充有哺乳动物血清(例如胎牛血清和牛血清)，和/或生长激素或生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子)。作为选择地或此外，液体培养基(例如第一和/或第二液体培养基)可以是化学成分确定的液体培养基、不含动物来源组分的液体培养基、无血清液体培养基或含有血清的液体培养基。化学成分确定的液体培养基、不含动物来源组分的液体培养基、无血清液体培养基或含有血清的液体培养基的非性实例是商业上可获得的。[0139]液体培养基通常含有能量源(例如碳水化合物，如葡萄糖)、必需氨基酸(例如二十种氨基酸的基础组加上半胱氨酸)、维生素和/或以低浓度需要的其它有机化合物、游离脂肪酸和/或微量元素。如果需要，液体培养基(例如第一和/或第二液体培养基)可补充有例如哺乳动物激素或生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐和缓冲液(例如钙、镁、和磷酸盐)、核苷和碱基(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶和次黄嘌呤)、蛋白和组织水解物，和/或这些添加剂的任意组合。
[0140]在本文所述的任何方法中可用于培养细胞的多种不同的液体培养基是本领域已知的。可能在本方法中也有用的培养基组分包括但不限于，氧化还原试剂、化学成分确定的(CD)的水解物，例如，CD蛋白胨、CD多肽(两个或更多个氨基酸)和CD生长因子。液体组织培养基和培养基成分的其它实例是本领域已知的。技术人员会理解本文描述的第一液体培养基和第二液体培养基可为同一类型的培养基或是不同培养基。[0141]对于蛋白生产中使用的生物过程，目的蛋白(例如多聚体蛋白)在该生物过程期间的特定时间点存在于包含多个细胞的溶液中。在这些时间点期间，所述蛋白可以存在于几个可能的位置，包括例如包含多个细胞的生物反应器、容纳槽或非生物反应器的单元操作容器。
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补料分批生物反应器
[0143]可用于培养存在于具有蛋白的溶液中的多个细胞的生物反应器的一个非性实例是补料分批生物反应器。在补料分批生物反应器中培养细胞包括，在培养期间的大部分时间，向第一液体培养基添加(例如周期性或连续添加)第二体积的第二液体培养基。第二液体培养基的添加可以连续地(例如以某个速率，该速率将生物反应器体积或该第一液体培养基体积的0.1％至300％(例如，1％至250％，1％至100％，100％至200％，5％至150％，10％至50％，15％至40％，8％至80％，和4％至30％)的体积历时任意给定的时间段(例如历时24小时的时间段，历时约1小时至约24小时的渐增的时间段，或历时超过24小时的渐增的时间段)添加)或周期性地(例如，每三天一次、隔天一次、每天一次、每天两次、每天三次、每天四次或每天五次)进行，或其任意组合。在周期性进行的情况下，添加的体积(例如，在约24小时期间内，在约1小时至约24小时的渐增时间期间内，或在超过24小时的渐增时间期间内)可为例如生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％至300％(例如，1％至200％、1％至100％，100％至200％，5％至150％，10％至50％，15％至40％，8％至80％和4％至30％)。
[0144]灌注生物反应器
[0145]本文所述的培养步骤可使用灌注生物反应器进行。在灌注生物反应器中培养细胞包括从生物反应器中去除第一体积的第一液体培养基(例如含有任何浓度的细胞的，例如基本上不含细胞的第一体积的第一液体培养基)，并向该第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基。去除和添加可以同时或序贯进行，或者以两种方式的组合进行。此外，去除和添加可以连续地或周期性地进行，或者其任意组合。在一些情况中，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基可以在每24小时的时间段内(或者，作为选项地，在约1小时至约24小时的渐增的时间段或超过24小时的渐增的时间段)在整个或部分培养期间维持大致相同。如本领域已知的，去除第一体积的第一液体培养基的速率(体积/单位时间)和添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/单位时间)可以有所变化。去除第一体积的第一液体培养基的速率(体积/单位时间)和添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/单位时间)可以是大致相同的或可以是不同的。使用灌注生物反应器来培养细胞用于蛋白生产是在本领域中充分描述的。
[0146]本文所述的任何生物反应器的内表面可具有至少一个涂层(例如明胶、胶原蛋白、聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白的至少一个涂层)，和如本领域已知的用于喷射O2、CO2和N2至液体培养基中的一个或多个端口，和用于搅拌液体培养基的搅拌机构。生物反应器可在受控的湿润气氛(例如在大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的湿度，或100％的湿度)中温育细胞培养物。生物反应器还可配备有能够从生物反应器去除一定体积的液体培养基的机械装置，和任选地在将该液体培养基转移出该生物反应器的过程期间从该液体培养基去除细胞的该机械装置内的过滤器(例如ATF系统)。[0147]根据本发明的方法，溶液中的蛋白浓度可以大于约1.0mg/mL、大于约1.5mg/mL、大于约2.0mg/mL、大于约2.5mg/mL、大于约3.0mg/mL、大于约3.5mg/mL、大于约4.0mg/mL、大于约4.5mg/mL、大于约5.0mg/mL、大于约5.5mg/mL、大于约6.0mg/mL、大于约6.5mg/mL、大于约7.0mg/mL、大于约7.5mg/mL、大于约8.0mg/mL、大于约8.5mg/mL、大于约9.0mg/mL、大于约10.0mg/mL、大于约12.5mg/mL或大于约15.0mg/mL。在一些实施方案中，本发明的方法中含
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有细胞的溶液中的蛋白浓度为约0.01mg/mL至约20mg/mL。在其它实施方案中，本发明的方法中无细胞溶液中的蛋白浓度为约0.1mg/mL至约100mg/mL。[0148]总体而言，除非另有说明外，本发明的实施采用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其是例如免疫球蛋白技术)的常规技术，和电泳中的标准技术。参见例如Sambrook等,19,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Paul,S.(编),1995,Antibody engineering protocols(Vol.51).Humana Press；McCafferty等(编),1996,Antibody engineering:a practical approach,Practical Approach Series,169,IRL press；Harlow等(编),1999,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Ausubel等,2007,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY；Bousse等,2001,Anal.Chem.73:1207-1212；Knapp等,2001,Proceedings of theμTAS 2001Symposium,Micro Total Analysis Systems 2001,7-10,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,Netherlands；Mhatre等,1999,Rapid Commun Mass Spectrom.13(24):2503-10。在这些出版物中公开的技术通过提述以其整体并入本文。[0149]除另有定义外，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。本文描述科学技术和材料用于本发明中的使用；其它合适的技术和材料也可以使用。材料、技术和实例仅是说明性的，并不意在进行。所有的出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目以及本文提及的其它参考文献都通过提述以其整体并入本文。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。[0150]如下实施例说明了本发明的具体实施方案，及其多种用途。它们仅出于解释性目的阐述，并且不应理解为以任何方式对本发明范围进行。实施例
实施例1.控制IgG4半抗体的比例：未澄清的收获物的评估[0152]总体方法
[0153]在未澄清的细胞培养收获物中研究了控制IgG4半抗体水平的能力，其是一个含有细胞的系统。在本实施例中，使补料分批生物反应器运转终止时获得的未澄清的收获物经历多种实验条件，并作为时间的函数检测IgG4群体中存在的半抗体(Hab)的百分比。关键实验条件包括如下：未澄清的收获物维持时间、维持温度和收获时的(由收获日控制的)细胞存活力。与半抗体水平一起，次要实验输出包括多种溶液相参数，如pH、活细胞密度和溶解的气体。
[0154]材料、方法和分析技术[0155]为了测量半抗体含量，未澄清的收获样品纯化通过如下进行：0.2μm过滤，然后是使用填充有获取自GE Life Sciences的MabSelect SuRe树脂的PreDictor Robo柱(200μL)在Freedom EVO 150Tecan液体处理器上的纯化。通过非还原性SDS-PAGE进行半抗体分析。在非还原条件下的SDS-PAGE根据标准技术进行(例如参见Sambrook等,19；Ausubel等,2007)。用Simply Blue SafeStain(Life Technologies，目录号LC6065)进行凝胶的染色。从扫描的凝胶图像测量半抗体的水平并通过光密度计对其进行定量。[0156]未澄清的收获样品的制备和处理
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[0151]
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将大约20mL未澄清的收获物分配至多个20mL PETG瓶，使顶部空间最小。设计将未
澄清的收获物分配成20mL样品的步骤，以通过将未澄清的收获物转移至搅拌式培养瓶(spinner flask)中从而确保每个样品的均质和无菌，所述搅拌式培养瓶受到持续搅拌，同时通过连续移液获得样品。瓶仅打开一次用于分析和/或纯化。在分配未澄清的收获样品期间需要特别小心地控制初始细胞密度。在指定的时间点，测试未澄清的收获样品的溶液相特征如pH、溶解的气体和活细胞密度，然后进行捕获纯化。然后测定经纯化的样品的Hab含量。
[0158]在本实施例中呈现的实验的结果也在2L和5L未澄清的收获样品中得到了确认，其使用一次性袋收集。因此，本发明的方法的规模可放大到较大体积的抗体生产，如在抗体的商业生产和/或制造中。
[0159]实施例2.维持时间：未澄清的收获物
[0160]在主要实验研究中对几个关键变量进行了研究，以证明控制抗体样品中存在的IgG4半抗体水平的能力。这些关键变量包括未澄清的收获物维持时间、维持温度和初始活细胞密度(由收获时的存活力控制)。
[0161]为了针对每个实验建立基线半抗体比例值，测量了使用传统规程制备的抗体样品中半抗体的含量，所述传统规程由0分钟维持时间组成(例如没有维持步骤)并且不根据本发明的方法调整任何其它条件。这种纯化的样品的半抗体含量平均为约21％(如通过非还原性SDS-PAGE所测定)。
[0162]未澄清的收获液从治疗性IgG4分子的补料分批培养物中获得。在带有Delta V控制的15升Broadley James玻璃容器中进行细胞培养。在整个未澄清的收获样品维持期间，使用Vi-Cell Cell Viability Analyzer(Beckman Coulter)测量活细胞密度和存活力百分比，并使用Blood Gas Analyzer(Siemens)测量pH、pCO2和pO2。[0163]取决于不同的测试条件，在细胞存在下维持生物治疗性IgG4能够减少、增加或大致维持抗体群体中存在的半抗体水平。这些实验的结果示于图3。[01]实施例3.初始活细胞密度：未澄清的收获物
[0165]在本研究中测试的第二个主要实验变量或控制参数是初始活细胞密度(图3B和3D)。
[0166]在两个不同的收获日获取生物反应器样品，代表了大约70％和35％的细胞存活力。在本实验中，初始活细胞密度评估为4.5×106个细胞/mL(来自补料分批反应器的较早收获日)或2.5×106个细胞/mL(来自补料分批反应器的较晚收获日)。维持温度在两个测试细胞密度条件之间维持恒定在8℃。在本实验中，对于具有2.5×106个细胞/mL的相对较低的初始活细胞密度的8℃样品而言，半抗体水平没有降低。[0167]在仔细分析时，观察到一旦活细胞密度测量结果降低至约2×106个细胞/mL，在任一实验测试条件都不再发生进一步半抗体减少(图3)。在具有不同初始活细胞密度的两种样品中都观察到了这个现象。在整个数据集中观察到了Hab转化对活细胞密度的强烈依赖性，并且图3B和3D中所呈现的结果意为代表性的。[0168]实施例4.维持时间：未澄清的收获物
[0169]将未澄清的收获物维持在三种不同的温度：2-10℃(冷室)、20-22℃(环境温度)和37℃(暖室)。
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从对实验结果的分析中出现了几个潜在的控制参数。发现半抗体含量受到未澄清
的收获物中活细胞的存在的显著影响。[0171]在图3A中，在冷温度(8℃)维持条件观察到了半抗体最为显著的降低，其对应于在本研究中评估的最高水平的活细胞密度。在暖条件(37℃)处的半抗体趋势既包括从21％至19％的立刻降低，又包括最终增加至约25％的最终半抗体水平。在37℃半抗体进展从降低到增加的变化直接对应于样品中存在的所有细胞都不再存活的点(图3B)，这是对于活细胞在半抗体控制过程中的重要作用的另一指示。[0172]因此，在含有细胞的(未澄清的)收获物维持条件中升高的温度的影响指示了一个能够增加半抗体水平的控制参数。[0173]实施例5.维持过程中的搅拌：未澄清的收获物[0174]除了维持温度方面的变化，通过将选择的未澄清收获物的样品在维持期间置于旋转器上测试了混合或搅拌的作用，并使其它样品在整个维持过程中维持静止(静态)。[0175]还研究了混合含有细胞的溶液对IgG4半抗体水平的作用(图4)。将低初始活细胞密度样品(来自图3C)维持在(1)静态的、不混合状态，或是(2)使用旋转器连续混合。混合未澄清的收获物溶液能够显著加速半抗体的减少，在8℃维持两周之后达到大约13％的半抗体，相比之下在同样这些时间和温度条件下不进行任何混合时半抗体大于20％(图4)。[0176]实施例6.向含有细胞的系统添加氧化还原试剂：未澄清收获物的评估[0177]为了进一步加快半抗体向完全抗体的转化，将氧化还原试剂(具体为还原型和氧化型谷胱甘肽)直接添加到含有细胞的系统(未澄清的收获物)中，然后进行纯化和分析评估。将未澄清的收获样品维持在8℃。[0178]在第一个实验中，未澄清的收获样品中的初始细胞存活力低，仅为2.5×106细胞/mL。虽然这种低细胞存活力条件在不存在谷胱甘肽时在半抗体方面并没有表现出任何改变(图5，圆圈)，但是谷胱甘肽的添加，无论是用5mM氧化型谷胱甘肽和0.5mM还原型谷胱甘肽(图5，方形)或是用0.5mM氧化型谷胱甘肽和5mM还原型谷胱甘肽(图5，三角)，均显著减少了半抗体并且这样做远快于在任何所研究的不含氧化还原试剂的条件。[0179]如图5中所示，实现的最低半抗体水平为如下条件：使用0.5mM还原型谷胱甘肽和5mM氧化型谷胱甘肽、在大约4天内维持在8℃下含有细胞的收获物条件中(图5，三角)。有可能该低半抗体含量是在早于4天的某个时间实现的。然而，对于这些条件最早的时间点测量是四天。对于使用更高水平的还原型谷胱甘肽的条件(5mM还原型谷胱甘肽与5mM氧化型谷胱甘肽的比例)，也观察到了显著降低的半抗体，尽管只在两个星期的更长温育期之后。(图5，方形)。
[0180]实施例7.向含有细胞的系统添加氧化还原试剂：在生物反应器操作期间[0181]在第二个实验中，通过将2-MEA直接添加至生物过程中一个不同的含有细胞的系统中，即一个生物反应器内，评价了另一氧化还原试剂，即2-MEA。使用氧化还原试剂还研究了生物反应器pH对半抗体控制的影响。具体而言，通过添加氧化还原试剂连同两种pH水平(高pH：7.1，低pH：6.9)在生物反应器培养物中研究了0.5mM和2mM 2-MEA以及5mM还原型谷胱甘肽(GSH)。该研究的结果示于图6。培养物的pH被确定为不会对Hab转化和Hab稳定性产生影响，指示对于在生物反应器含有细胞的系统中测试的条件而言，通过添加氧化还原试剂进行的Hab转化相对于pH是稳固的。
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对含有细胞的生物反应器内半抗体比例的这些研究指示，2-MEA是测试的最有效
的氧化还原剂，并且2mM 2-MEA的浓度有效地将生物反应器中Hab的比例控制在8-10％之内至少24小时(图6，方形和三角)。对于所有的测试条件，Hab的比例在氧化还原试剂添加后的最早期显著下降，对于所有情况达到了10％以下，除了一个条件以外(图6)。有趣的是，除了2mM 2-MEA的其它所有条件，Hab比例随时间增加至接近初始Hab水平。(图6)。复原回半抗体最为迅速的是0.5mM 2-MEA，指示氧化还原试剂的浓度可为控制抗体溶液中的Hab比例的关键参数。
[0183]还进行了另外的实验以确定生物反应器内的初始细胞存活力对Hab进展的潜在影响以及2-MEA实现Hab比例控制的能力。在本研究中，将2mM2-MEA添加到接近补料分批生物反应器运转的运行结束时的两个单独的生物反应器中，其具有70％或45％的细胞存活力(分别为第12和14天)。在两个生物反应器中，添加2-MEA均能够在添加后几乎立即将Hab比例降低至10％以下。(图7)。与上文所述关于细胞存活力的观察结果相一致，生物反应器内Hab比例作为时间的函数依赖于2-MEA添加之时的初始细胞存活力。在较低的初始存活力(45％)，Hab比例在暴露于生物反应器中的2-MEA 24小时之后从8％增加到14％(图7，方形)。然而，具有较高的初始存活力(70％)的培养在历时24小时暴露于生物反应器中的2-MEA的过程中得到了稳定的Hab概貌(图7，圆圈)。这些结果指示了生物反应器中培养物的活细胞密度能够影响Hab向完全抗体转化的稳定性。
[0184]实施例8.向含有细胞的系统添加氧化还原试剂：在细胞去除后评估稳定性
[0185]在通过从未澄清的收获样品去除细胞和细胞碎片来去除细胞以生成对应样品的澄清的收获物之后，对于在含有细胞的系统中使用氧化还原试剂将Hab转化成完全抗体的稳定性也进行了评估。在这项研究中，将含有细胞的系统(生物反应器)用2mM 2-MEA处理24小时。未澄清的收获物的样品取自含有细胞的系统，然后澄清以去除细胞和细胞碎片，因此得到澄清的收获物。监测温育箱中不同条件下维持的澄清的收获样品的等分试样中的Hab比例，该条件包括两个温度(或者是2-8℃或者是21℃/室温)，以及经由气体顶部空间操纵的不同幅度的pH升高。其结果示于图8。[0186]这些测量的结果指示，温度可以充当另一用于半抗体控制的参数。例如，当在2-8℃维持2-MEA处理的澄清的收获物时，Hab的比例从维持时间开始时(t＝0)测量的9-10％在历时七天的过程中降至6％。(图8，实心和空心菱形)。相反，当维持在室温时(21℃)，Hab在2-MEA处理的澄清的收获物中的比例在历时七天的过程中实际上有所增加(图8，实心和空心三角)。
[0187]在存储在没有顶部空间(图8，实心三角/菱形)的澄清的收获样品和存储在具有顶部空间的那些收获样品(图8，空心三角/菱形)之间没有观察到差异。这个特定实验的结果指示，pH漂移没有影响所研究的条件下经2-MEA处理的澄清的收获物中的Hab比例。[0188]这些研究指示，将氧化还原试剂如2-MEA和谷胱甘肽直接添加至接近运行结束处的含有细胞的生物反应器可用于控制过程中存在的半抗体的比例。此外，这些使用氧化还原试剂的研究已评估了选择的参数对Hab比例控制的影响，该参数包括氧化还原试剂本体和浓度、pH值和细胞存活力。
[01]实施例9.在无细胞系统中控制IgG4半抗体的比例：对向澄清的收获物添加氧化还原试剂的评估
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进行研究以进一步评估直接向澄清的收获材料添加2-MEA，所述澄清的收获材料
是无细胞样品。在这些实验中，澄清的样品分别接受2mM 2-MEA或不接受氧化还原试剂，接着在或者2-8℃或者室温(21℃)下进行温育维持。在历时7天(168小时)的温育中测定了Hab的比例。最先的2个小时的结果示于图9，而到7天时得到的结果示于图10。这些结果指示，添加2-MEA后然后在8℃进行温育能够将Hab比例显著降低至10％以下(图9，三角)，并且Hab比例维持在10％以下至少7天(图10，三角)。对于在室温(21℃)温育的含有2-MEA的样品，在添加2-MEA之后Hab比例几乎也立即迅速降低(图9，菱形)。然而，对于温育的第1-7日，Hab水平在初始的下降达到大约11％Hab的持续水平后不久增加(图10，菱形)。在对照样品中，储存在8℃或室温(21℃)无2-MEA条件下的材料在Hab比例方面(图9，方形；图10，圆圈)没有变化。
[0191]这项研究指示，氧化还原试剂如2-MEA可直接添加到无细胞系统如澄清的收获物以实现半抗体控制。此外，这种选项代表了生物过程中Hab比例可得到控制的另一个阶段。还研究了温度对用2-MEA处理的澄清的收获物的影响，并且发现与上述对于在过程中较早时向含有细胞的系统生物反应器添加2-MEA的情况下的澄清的收获样品所观察结果一致。当设计对Hab比例具有充分控制的生物过程时，在过程中的多个时间点使用氧化还原试剂如2-MEA控制Hab比例的能力提供了灵活性。[0192]实施例10.产品质量的确认
[0193]分析了根据上述实施例经过了2-MEA处理的几个来自澄清和未澄清的收获物的样品的多个产品质量属性，包括糖基化概貌、荷电变体、质谱概貌和通过凝胶电泳得到的纯度。在所有情况下，在未处理和处理过的样本之间没有观察到差异，除了样品中存在的半抗体水平(数据未显示)。
[0194]实施例11.控制无细胞系统中IgG4半抗体比例：对捕获后溶液的评估[0195]总体方法
[0196]对还原剂和氧化剂进行了研究，以评估控制无细胞系统中IgG4半抗体水平的能力。在本研究中，将纯化自细胞培养物收获材料的捕获蛋白A洗脱液(捕获后溶液)用于研究影响半抗体水平的控制参数。假定还原剂如2-巯基乙胺(2-MEA)能够有效减少抗体样品中的半抗体含量。进行了优化减少半抗体的条件的研究，评估了温育条件如pH、时间、温度、2-MEA的浓度和IgG4的浓度。[0197]材料、方法和分析技术[0198]实验流程：未澄清的收获材料收集自IgG4抗体的补料分批培养物，通过过滤澄清，然后用装填有MabSelect Sure蛋白A树脂(GE Healthcare)的柱纯化。将蛋白A洗脱液调整至指示的实验条件，温育，然后通过使用填充有MabSelect SuRe蛋白的PreDictor Robo Column(200uL)再纯化以去除任何添加的还原试剂或氧化试剂。通过使用获得自Invitrogen的4-20％Tris甘氨酸凝胶对蛋白A Robo Column再纯化洗脱液进行了非还原性的SDS凝胶分析。用Simply Blue SafeStain(Life Technologies，目录号LC6065)进行了凝胶的染色。从扫描的凝胶图像测量了半抗体水平并通过光密度计进行定量。一个示例性凝胶示于图11中。
[0199]实施例12.向无细胞系统添加氧化还原试剂：对捕获后溶液的评估
[0200]对几种还原和氧化试剂测试了它们减少或增加捕获后溶液的IgG4群体中存在的
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半抗体水平的能力。2-MEA在降低蛋白A洗脱液(捕获后溶液)的IgG4半抗体水平方面与测试的其它还原剂(其包括2-巯基乙醇和还原型谷胱甘肽(GSH))相比是最有效的。在这项筛选研究期间对于所有氧化还原试剂测试条件将pH维持恒定在4.8。也测试了氧化还原试剂二硫苏糖醇(DTT)，但被证明不适合于根据所描述的方法的使用。据观察，DTT减少了完整IgG4抗体成为重链和轻链片段，并且和也增加了半抗体的水平(图11，泳道8)。由于重链和轻链片段的存在，不能精确地计算DTT样品中Hab的百分比。其结果示于表1并进一步示于图11。[0201]有趣的是，向蛋白A洗脱液添加氧化型谷胱甘肽(GSSG)对在2-MEA或还原性谷胱甘肽存在下所观察到的半抗体减少没有可测量的影响(表1)。[0202]表1：多种氧化还原试剂在控制半抗体水平方面的评估。泳道#对应于图11所示的凝胶
[0203]
样品泳道#半抗体(％)蛋白A洗脱液124.5蛋白A洗脱液+2mM 2-MEA216.2蛋白A洗脱液+3mM 2-MEA316.9蛋白A洗脱液+2mM 2-MEA+2mM GSSG416.6蛋白A洗脱液+2mM GSH521.3蛋白A洗脱液+2mM GSH+2mM GSSG620.6蛋白A洗脱液+2mM 2-巯基乙醇718.4PA洗脱液+2mM DTT8N/A*[0204](*)–生成了重链和轻链片段。因此未对半抗体比例进行定量，[0205]实施例13.氧化还原试剂2-MEA的浓度对半抗体比例的影响[0206]显示2-MEA对于减少Hab含量是测试的最有效的还原剂，并因此将其选择用于进一步的实验。为了评价2-MEA对产品质量的影响，评估了不用和用2-MEA调整(在最佳条件下)的蛋白A洗脱液(约9-10mg/ml总抗体)。设计这些实验来研究2-MEA浓度对澄清的样品中半抗体水平的影响。测试的2-MEA浓度列于表2并且范围从0mM至50mM。在不存在任何2-MEA(0mM)的情况下，观察到Hab含量为27％(表2)。然而，在0.5和5mM之间的2-MEA浓度，样品中的IgG4半抗体的水平降低(表2，粗体行)。最值得注意的是，在1mM 2-MEA的存在下，半抗体的水平从27％降低至15.2％。较高浓度的2-MEA(25mM和50mM)导致了半抗体水平的增加(46和58％)，并且还产生了重链和轻链片段(表2)。[0207]有趣的是，在2-MEA存在下(1、2和3mM于pH 4.8)半抗体水平在大约30分钟内下降。对于5、15和22小时温育观察到了类似幅度的减少，这指示平衡条件迅速实现，并且延长的温育是不利的(结果未示出)。[0208]表2：2-MEA浓度对蛋白A洗脱液中半抗体水平的影响
[0209]
2-MEA的浓度(mM)00.51
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半抗体(％)2716.715.2
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16.324.846.1N/A*
[0210](*)-生成了重链和轻链片段。因此没有对半抗体比例进行定量。[0211]实施例14.pH对半抗体比例的影响
[0212]还研究了澄清的抗体样品的pH对半抗体水平的影响。含有0mM或2mM浓度的2-MEA的抗体样品在4.0、4.8或7的pH值处进行了测试。[0213]对于含有2mM的2-MEA的抗体样品，半抗体水平的降低在较低的pH(4.0和4.8)比中性pH 7.0(表3)大得多。在pH 4处，半抗体水平从不存在2-MEA(0mM)时的27.1％降低至包含2mM 2-MEA浓度的溶液中的20.8％。(表3)。在pH4.8处，半抗体水平从不存在2-MEA(0mM)时的28.9％降低至包含2mM 2-MEA浓度的溶液中的20.4％。(表3)。然而，在pH7时，半抗体水平从不存在2-MEA(0mM)时的27.4％仅降低至包含2mM 2-MEA浓度的溶液中的24.5％。(表3)。[0214]在蛋白A洗脱溶液中添加氯化钠至40mM的浓度在pH 4.8或中性pH 7.0在2mM 2-MEA的存在下对半抗体减少的水平没有可测量的影响(表3)。[0215]表3：pH和氯化钠浓度对于控制半抗体水平的影响
252550
[0216]
[0217]
在2-MEA的存在(1，2和3mM于pH 4.8)下，半抗体水平在30分钟内下降。使用延长的
温育时间(5、15和22小时)的类似结果指示，平衡条件迅速实现(数据未显示)。[0219]实施例15.关键因素鉴定
[0220]为了鉴定在2-MEA存在下影响澄清的蛋白A洗脱溶液中半抗体水平的(多个)关键因素，使用五个因素进行了完全双水平析因实验(full two-level factorial experiment)：pH、温度、温育时间、还原剂(2-MEA)浓度和IgG4的浓度。基于上述实施例中公开的实验结果，以及先前进行的多种其它范围确定和优化实验，为该五个因素选择了低值和高值。在这些实验中测试的值示于下表4中，并将代表性的凝胶示于图12。[0221]表4：具有5个中心点重复的2水平完全析因设计的低和高设定点
[0222]
[0218]
pH(单位)温度(℃)低3.48
30
高622中心点4.715
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时间(小时)0.563.252-MEA(mM)0.531.75IgG4(mg/ml)42012[0223]测试了三十七个样品。蛋白A洗脱液中测量的半抗体初始水平(18.5％)在低浓度的2-MEA(0.5和3mM)存在下在pH 3.4于30分钟内降低至8-9％。在这个特定实施例中，研究的其它因素，包括温度、时间、2-MEA浓度和IgG4浓度，在所研究的范围内没有显示出对半抗体水平具有统计学上显著的影响。[0224]总的来说，这些结果指示，IgG4半抗体的水平能够通过向捕获后溶液(如蛋白A洗脱液)添加氧化还原试剂2-MEA来有效地控制。
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