应用尖孢镰刀菌培养滤液室内鉴定百合品种抗病性研究

江西农业大学学报２０１　１，３３（２）：０２７５—０２７７　ｈｔｔｐ：／／ｘｕｅｂａｏ．ｊｘａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　Ｅ—ｍａｉｌ：ｎｄｘｂ７７７５＠ｓｉｎａ．ＣＯｒｎ　Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｅｕｈｕｒａｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ　Ｊｉａｎｇｘｉｅｎｓｉｓ　应用尖孢镰刀菌培养滤液　室内鉴定百合品种抗病性研究　彭绿春　，杨秀梅　，苏　艳　，瞿素萍　，崔光芬　，陆　琳　（１．云南省农业科学院花卉研究所／农业部花卉产品质量监督检验测试中心，云南昆明６５０２０５；２．云南省农业科　学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明６５０２２３）　摘要：采用百合尖孢镰刀菌培养滤液，首次在瓶内对百合组培苗８个品种进行镰刀菌枯萎病抗性鉴定，结果鉴　定出高抗品种３个，中抗品种３个，中感品种２个，初步建立起百合品种镰刀菌枯萎病抗性室内鉴定的方法。　关键词：尖孢镰刀菌；百合品种；室内抗性鉴定　中图分类号：￥６８２．２　９　文献标志码：Ａ　文章编号：１０００—２２８６（２０１１）０２—０２７５—０３　Ａ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ａｓｅｐｔｉｃ　Ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｆｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　Ｌｉｌｙ　Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ　ｔｏ　Ｔｏｘｉｎ　Ｆｉｌｔｒａｔｅ　Ｆｒｏｍ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ｆ．ｓｐ．Ｌｉｌｉｉ　ＰＥＮＧ　Ｌｖ．ｃｈｕｎ　，ＹＡＮＧ　Ｘｉｕ．ｍｅｉ　，ＳＵ　Ｙａｎ　，　ＱＵ　Ｓｕ—ｐｉｎｇ　，ＣＵＩ　Ｇｕａｎｇ—ｆｅｎ　，ＬＵ　Ｌｉｎ　（１．Ｆｌｏｗｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｙｕｎｎａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｃｅｎ—　ｔｒｅ　ｆｏｒ　Ｆｌｏｗｅｒｓ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５０２０５；２．Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ａｎｄ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｓｔｉ—　ｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｙｕｕｎａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５０２２３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔ　ｌｉｌｙ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ　ｔｏ　ｔｏｘｉｎ　ｆｉｌｔｒａｔｅ　ｆｒｏｍ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ｆ．ｓｐ．Ｌｉｌｉｉ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｓｅｐｔｉｃ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｔｉｍｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｔｈｒｅｅ　ｈｉｇｈｌｙ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｖａｒｉｅ—　ｔｉｅｓ，ｔｈｒｅｅ　ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ａｎｄ　ｔｗｏ　ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ．Ｍｏｒｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔｌｙ，ａ　ｍｅｔｈ—　ｏｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉ￣ｉｎｄｏｏｒｓ　ｔｈｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｌｉｌｙ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ　ｔｏ　ｔｏｘｉｎ　ｆｉｌｔｒａｔｅ　ｆｒｏｍ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ｆ．ｓｐ．Ｌｉｌｉｉ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ｆ　ｓｐ．Ｌｉｌｉｉ；ｌｉｌｙ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ；ｉｎｄｏｏｒ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｄｅｎｔｉｉｃａｔｉｏｎ　ｆ百合是世界四大鲜切花之一，也是云南省主栽花卉之一，深受人们喜爱，并且在生产和贸易中表现　出了较大的经济效益。但由于近年来种植面积不断扩大和连年种植，其病害变得日益严重，由百合尖孢　镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ｆ．ｓｐ．Ｌｉｌｉｉ）引起的枯萎病，又称茎腐病，是百合重要病害之一。该病导致百　合种球和鳞片腐烂，严重威胁百合种球和切花生产产量和质量。镰刀菌可随土壤、种球传播，百合种球　贮运、贸易以及二代种球的种植加速了该病在全世界百合种植区的蔓延和流行　。由于真菌对杀菌　剂抗性的不断增强和环境因子的影响，使用化学防治对该病收效甚微，因此应用抗病品种和选育抗病品　种是控制百合镰刀菌枯萎病的首选措施。但常规的抗性鉴定费时费工，且易受环境条件影响。而Ｃｕｒｉｒ　收稿日期：２０１０—１０—２９　修回日期：２０１１—０２—０４　基金项目：国家科技支撑计划项目（２００７ＢＡＤ４５Ｂ０４）　作者简介：彭绿春（１９８１一），女，硕士，主要从事花卉质量控制与植物繁育技术研究，Ｅ～ｍａｉｌ：ｇｒｅｅｎ３１５＠１２６．ｃｏｎｌ；　通讯作者：瞿素萍，副研究员，Ｅ—ｍａｉｌ：ｑｕｓｕｐｉｎｇ２００２＠ｓｉｎａ．ｔｏｍ。　・２７６・　江西农业大学学报　第３３卷　等　研究证实镰刀菌毒素会导致无菌培养的两个百合品种鳞片出现中毒现象。故在前人研究尖孢镰　刀菌产毒条件的基础上　Ｉ６］，首次应用尖孢镰刀菌培养滤液，对８个品种百合组培苗进行瓶内抗病性鉴　定，旨在探索出一套快速、简便鉴定抗性的方法，以缩短选育抗病品种周期。　１材料与方法　１．１试验材料　供试的８个百合品种来自云南省农科院花卉所质检中心组培室，为生长正常、长势一致、无污染的　组培瓶苗。病原菌为百合枯萎病株上分离得到的尖孢镰刀菌致病菌株，于马铃薯（ＰＳＡ）培养基上保存　待用。　１．２试验方法　１．２．１毒素滤液制备菌株移接在ＰＳＡ平板培养基上，于２５℃下培养１周，沿菌落边缘打出直径为　８　ｍｍ菌饼，接入装有２００　ｍＬ查氏培养液的５００　ｍＬ三角瓶内，每瓶接８片，置于摇床上，光照、振荡、室　温培养约２６～２９　ｄ　－５／。培养滤液经过滤（先用四层纱布，再用两层滤纸），滤液离心３０　ｒａｉｎ（３　０００　ｒ／　ｍｉｎ），弃去沉淀，上清液煮沸１５　ｍｉｎ后，作为毒素原液保存于４℃冰箱待用　。　１．２．２　接种　（１）鉴定浓度的筛选。配制毒素体积分数为（毒素原液与培养基体积比）０％，２０％，　４０％，６０％的百合繁殖培养基：ＭＳ＋ＢＡ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ，ｐＨ　５．８，高压灭菌１５　ｍｉｎ，以Ｓｏｒｂｏｎ．　ｎａ和“发光”为材料，待百合小植株长至１～１．５　ｅｍ高，在基部切去一小薄片后，接人培养基中，每瓶接　１５棵，每个体积分数５瓶。（２）不同品种抗性鉴定。配制适宜毒素体积分数的百合繁殖培养基，按（１）　中的方法接种８个百合品种组培　表１病情分级标准　苗，每瓶接１５棵，每个品种５瓶。　Ｔａｂ・１　Ｄｉｓｅａｓ　ｇｒａｄｉｎｇ　ｓｔａ“ｄａｒｓ　每个品种设一瓶对照，对照培养　等级Ｒａｎｋ　基里不添加毒素滤液。　１．２．３病情调查及抗性分级标　发病情况Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　ｄｅｇｒｅｅ　不发病（与对照相同）　基部切口处变灰黑色　基部切口处变灰黑色，外层叶片枯萎，病度不超过１／２　整个基部腐烂　整个基部腐烂，叶片向上部枯萎，病度不超过１／２　准接种后，陆续观察记录发病　情况，并于１周后统计。病情分　级标准见表１。　病情指数／％＝［∑（病级苗　数Ｘ病级）／（苗数总和×发病最　重级）］×１００　６０．０１～８０．００，高感（ＨＳ）≥８０．０ｌ。　整个基部腐烂，叶片向上部枯萎，病度超过１／２　（１）　抗性等级按样本的平均病情指数划分，高抗（ＨＲ）≤４０．００，中抗（ＭＲ）４０．０１—６０．００，中感（ＭＳ）　２结果与分析　２．１　百合组培苗室内抗性鉴定适宜毒素浓度　接种１周后，两品种不同浓度处理的培养基中，百合苗切口处变灰黑色，并扩散到周围培养基，有的　还出现出基盘及叶片枯腐等损伤表现，株高也明显低于对照，并随浓度增加，损伤加重。两品种随浓度　增加，损伤变化趋势相同，但“发光”较Ｓｏｒｂｏｎｎａ受损轻，“发光”受损大部分只是切口处灰黑，或基部外　层叶片枯腐，少有整个基盘枯腐的。毒素浓度６０％培养基中，苗受损率达到１００％，其中Ｓｏｒｂｏｎｎａ大部　分整个基盘都枯腐；毒素浓度４０％时，苗受损率超过８０％，其中Ｓｏｒｂｏｎｎａ大部分整个基盘都枯腐；毒素　浓度２０％时，苗受损率约５０％。借鉴辐射诱变育种和抗性筛选中的半致死剂量和浓度的原则　一ｌｏ］，可　见２０％为百合组培苗室内抗性鉴定的适宜浓度。　２．２不同品种百合组培苗对镰刀菌毒素抗性　接种２～３　ｄ后，可见百合组培苗基部切口处变灰黑，并扩散到周围培养基，随培养天数增加，基盘　出现不同程度枯腐，并向上蔓延至外层叶片，乃至内层叶片。不同品种表现出不同的受伤程度，接种１　周后统计发病情况。抗性鉴定结果（表２）表明，发光、兰州百合、Ｅｌｉｔｅ的病情指数分别是３０．２２、２２．５０、　第２期　彭绿春等：应用尖孢镰刀菌培养滤液室内鉴定百合品种抗病性研究　・２７７・　ｌ８．２１，为高抗品种；Ｌｙｏｎ、ｓｏｒｂｏｎｎａ、Ｔ３的病情指数分别是４８．６２、５０．２５、５６．１０，为中抗品种；Ｓｉｂｅｒｉａ、Ｍａｒ—　ＣＯ　Ｐｏｌｏｎ的病情指数分别是６２．２５、７０．３０，为中感品种。所供试的８个品种中无高感品种。　３讨论与结论　试验中同一品种在不同培养滤液浓度的培养基中，受损程度不同，随毒素浓度提高，受损加重；不同　品种在同一浓度培养滤液培养基中受损程度也不同，鉴定结果与杨秀梅等　以鳞片为材料进行的田间　鉴定结果一致，初步可以说明用镰刀菌培养滤液室内鉴定百合品种枯萎病抗性是可行的。鉴于试验只　是初探阶段，仅从形态学方面对其病　情分级，划分抗性，以后一方面应增加　室内鉴定供试品种，并结合田间鉴定；　另一方面深入从防御酶系酶活性¨　、　组织超微结构　、植株再生能力变　化¨　等方面来共同划分抗性，以优　表２百合８个品种对镰刀菌枯萎病抗性鉴定结果　Ｔａｂ．２　Ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔ　ｌｉｌｙ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ　ｔｏ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ｆ．ｓｐ．Ｌｉｌｉｉ　化完善室内鉴定这一技术体系。　国内外前人关于抗病性室内鉴定　方面的研究，大多是先提取镰刀菌粗　毒素，再用固体粗毒素配制一定浓度　毒素溶液进行抗性鉴定。鉴于提取粗　毒素比较费时，且产量低，每次提取需　要的培养滤液量大，本研究对前人方　法稍作改进，省去镰刀菌粗毒素的提　取这一步，首次直接用培养滤液作为毒素原液进行鉴定。当然，两种方法各有优势，粗毒素法虽然比较　费时、工作量大，但固体粗毒素能保存的时间长、稳定、体积小、易保存；培养滤液法省时、省力、但保存时　间短，具体根据需要来选择不同的方法。　参考文献：　［１］ＳｔｒａａｔｈｏｆＴｈ　Ｐ，Ｊａｎｓｅｎ　Ｊ，Ｌｏｆｉｔｅｒ　Ｈ　Ｊ　Ｍ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｉｕｍ　ｉｎ　Ｌｉｌｉｕｍ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，　１９９３，８３（５）：５６９—５７２．　［２］潘其云，朱明德，邓建玲，等．百合镰刀菌枯萎病的发生与防治研究［Ｊ］．上海农业科技，２００４（３）：１０３—１０４．　［３］Ｃｕｒｉｒ　Ｐ，Ｇｕｇｌｉｅｒｉ　Ｌ，Ｄｏｌｃｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｆｕｓａｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ｆ．ｓｐ．Ｌｉｌｉｉ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｌｙ　ｂａｓａｌ　ｒｏｔ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０００，１０６：８４９—８５６．　［４］朱茂山，杨贺，关天舒．百合枯萎病菌生物学特性研究［Ｊ］．辽宁农业科学，２００８（３）：９—１１．　［５］马国斌，林德佩，王叶筠，等．培养条件对西瓜枯萎病菌镰刀菌酸产生的影响［Ｊ］．植物病理学报，１９９６，２６（２）：１８７—１９１．　［６］朱茂山，杨贺，关天舒，等．百合枯萎病菌生物学特性研究［Ｊ］．辽宁农业科学，２００８（３）：９—１１．　［７］台莲梅，许艳丽，高凤昌．尖孢镰刀菌的初步研究［Ｊ］．黑龙江八一农垦大学学报，２００４，１６（４）：９—１２．　［８］徐冠仁．植物诱变育种学［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９６：９４—９５．　［９］高健，卢惠萍．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