大肠埃希氏菌标准菌株的制备以及试剂验收分析

谢春华

【期刊名称】《《临床检验杂志(电子版)》》 【年(卷),期】2018(007)004 【总页数】2页(P595-596)

【关键词】微生物; 标准菌株; 培养基 【作 者】谢春华

【作者单位】江苏省南京市高淳区疾病预防控制中心 江苏南京211300 【正文语种】中 文 【中图分类】R378.21

微生物实验室的质量控制是微生物检测工作的重要组成部分[1-3]。标准菌株由于其是在遗传学特性上得到认可和保证的可追溯的菌株，所以其在食品微生物检测中可以起到一个阳性对照样本的作用[4]。不标准的试剂会直接影响到后续食品微生物检验，所以在检验工作开始之前，就要使用标准菌株对试剂进行检验，以保证食品微生物检验工作的准确进行。但国标[1]未详细说明怎样用标准菌株对试剂进行验证。大肠埃希氏菌是本实验室必备的标准储存菌株和工作菌株，为了对本实验室进行质量控制，笔者进行了以下实验，实验过程与实验结果分析如下。 1 材料与设备

1.1 质控标准菌株 购买大肠埃希氏菌标准菌种1支，菌种编号为ATCC25922（批

号：E00058，广东环凯微生物科技有限公司）。

1.2 主要试剂 伊红美蓝（EMB）琼脂（批号：20160125，青岛高科园海博生物有限公司）、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）（批号：20161230，青岛高科园海博生物有限公司）、EC肉汤（批号：20170717，青岛高科园海博生物有限公司）、营养琼脂斜面（批号：20170519，青岛高科园海博生物有限公司）、生理盐水（批号：20180509，国药集团化学试剂有限公司）、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）（批号：20170601，青岛高科园海博生物有限公司）、VRBA-MUG（批号：20170401，青岛高科园海博生物有限公司）。磷酸盐缓冲液-自配试剂。革兰氏染色液（批号：20180123，杭州滨和微生物有限公司）、大肠杆菌成套生化鉴定试剂盒（批号：20180515，青岛高科园海博生物有限公司）。所有试剂都在有效期范围内。

1.3 主要设备和材料 生物安全柜、隔水式恒温培养箱（36 oC±1 oC）、恒温水浴箱（44.5 oC±0.2 oC）、366 nm紫外线灯、pH计、高压蒸汽灭菌器、无菌吸管、无菌培养皿、无菌试管、小导管、三角烧瓶。

1.4 试剂的配制 试验用水很重要，采用新开的纯水。称重脱水合成培养基前需佩戴口罩。在不锈钢锅里先加一些水，将称好的培养基倒入并搅拌混合，然后再加剩余的水到所需的量后在电磁炉上加热，加热时不断搅拌，使其充分快速溶解。在培养基灭菌前使用pH计调节pH，通常用浓度为1 mol/L的NaOH或浓度为1 mol/L的HCL调节。选用合适的容器来分装配制好的培养基，这里要注意一点是容器的体积一定要大培养基体积的20%。在高压灭菌器中湿热灭菌，根据培养基试剂要求设定灭菌温度，一般情况下是121 oC下灭菌15 min。VRBA和VRBA-MUG不需要高压灭菌，只需煮沸完全溶解。所有培养基的配制都严格按照国标[2]附录A的要求配制，现配现用，防止存储时间过长对菌落形态有影响。 2 检验过程

2.1 标准菌株的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 生物安全柜内无菌操作开启真空冻干菌种管，用标准菌株内配套的脑心浸出液肉汤溶解冻干菌种，于36 oC±1 oC恒温培养箱中培养18 h-24 h，见试管内液体浑浊。用无菌吸管吸取浑浊物分别滴在6支营养琼脂斜面上，涂抹均匀后36 oC±1 oC培养18 h-24 h。取其中一支作为试验中质控管，其余5支取菌苔用磁珠管冻存于-70 oC超低温冰箱作为储备管，5支磁珠冻存管一一贴上标签，写上详细内容，包括：菌种名称、实验室编号、传代代次、传代日期、传代人、储存条件、有效期等。

2.2 菌种的纯度确认 从上述质控管中取菌苔放入生理盐水试管中研磨成5个麦氏度菌悬液，再将菌悬液用磷酸盐缓冲液10倍梯度稀释到10-8级。用接种环取菌悬液分别接种到LST肉汤管、EC肉汤管中，LST肉汤管放于36 oC±1 oC恒温培养箱，EC肉汤管放于44.5 oC±0.2 oC带盖水浴箱中，培养18 h-24 h后，LST肉汤管和EC肉汤管中的小导管内都有气泡，管中液体都见浑浊。用接种环取菌悬液接种到EMB琼脂平板，分区划线分离，接种环沾一次菌悬液连续划3块EMB琼脂平板，使其在平板上分离出单个菌落。EMB琼脂平板上全部菌落都是紫黑色，单个菌落中间是深紫色，中间突出，圆形，光滑，润湿，有金属光泽。

取稀释好的10-6-10-8稀释度的菌悬液按国标[2]第二法中6.2的操作步骤进行，培养后见平皿中10-7和10-8稀释度的菌落分散明显，菌落颜色为紫红色，菌落周围见红色的胆盐沉淀环。放入暗室中，在366 nm紫外灯下，平皿上的菌落周边呈微弱的蓝色荧光，但不明显。重新进行实验，取新鲜大肠埃希氏菌培养物，用同样的方法稀释到10-8级，方法1：按国标[2]第二法中6.2的操作步骤进行；方法2：方法1中往1 mL菌悬液的平皿中加VRBA的试剂，这次换成加VRBAMUG，然后再用VRBA-MUG覆盖。暗室下，366 nm紫外灯下见方法2平皿中菌落周围的荧光明显比方法1中的荧光强。VRBA的试剂成分比VRBA-MUG试剂成分少了4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷，这是一种底物。可见方法2的

荧光效果明显比方法1要好。

2.3 革兰氏染色镜检 用接种环沾取一环无菌生理盐水于洁净载玻片上，用少许EMB上的培养物涂成均匀涂片，待自然干燥，在火焰上方2次-3次来回移动固定，按说明书操作进行染色。染色结果为：革兰氏阴性无芽孢杆菌。

2.4 生化鉴定试验 根据说明书的要求，将上述5个麦氏度的菌悬液分别用于靛基质试验、MR-VP试验和柠檬酸盐利用试验。IMVIC鉴定结果为：++--（+为阳性，-为阴性）。 3 讨论

以上实验中质控菌株大肠埃希氏菌ATCC 25922在LST、EC管中的反应、在EMB、VRBA上的菌落形态等都符合国标[1]附录D中的要求。培养基空白无菌生长。革兰氏染色阴性及IMVIC生化试验为++-- ，也和大肠埃希氏菌标准菌株的生化特性相符。但按国标[2]第二法中的步骤做的实验效果不是很理想，改进后，方法2中的实验结果达到了理想的效果。由此说明这次质控所用的培养基、试剂、染色液等基本符合要求。暗室中366 nm紫外灯下观察大肠埃希氏菌在VRBA-MUG平板中的荧光，说明大肠埃希氏菌工作菌株作为食品中阳性对照样本的重要性，防止食品中会有漏检的发生。

革兰氏染色镜检在实验中起着重要的作用，它可以观察细菌的形态和染色情况，因此可对细菌作出识别。在选择培养基时也很重要，要购买正规公司生产的产品，配制培养基时要写上培养基的配制日期及有效期，保存温度也应注意等。总之，标准菌株质量控制是食品微生物检测结果的准确性和可靠性的保障。之所以实验室的质量控制这么重要，是因为通过质量控制考核可以确保实验室人员保持一定的检测水平，保证实验室的检测能力。实验过程中要注意生物安全防护，根据实验室生物安全管理的要求佩戴个人防护用品，并在生物安全柜内进行病原菌的全部操作。检测结束后所有病原菌培养物均需在121 oC高压灭菌处理。

参考文献

【相关文献】

[1]中华人民共和国卫生部.GB 47.28-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》: 131-182.

[2]中华人民共和国卫生部.GB 47.38-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验 大肠埃希氏计数》: 233-246.

[3]美丽坎·阿不都.微生物实验室的质量控制管理方法分析[J].中国社区医生,2016,32(13): 142-144. [4]穆晓东.标准菌株在食品微生物检验中的重要作用[J].食品安全导刊,2018(12): 111.