白头翁体外抗肿瘤实验研究

白头翁体外抗肿瘤实验研究　尺　ｚ　７，。，ｒ　解救军第４５４医院（南京２１００。２）　蔡　鹰＋　唐永明　梁秉文／　’———一——　——一　ｒ　擅　要通过活细胞计数法、ＭＴＴ法、集落形成试验，研究了白头翁水提液（ＰＷＥ）和醇提液　（ＰＡＥ）的体外抗肿瘤作甩。结果：精细胞计数表明ＰＷＥ对７７２１、Ｈｅ｜ａ、ＭＫＮ一４５细胞株７２　ｈ　１（５ｓｏ分　别为０．８８、０．２８、０．８６　ｍｇ／ｍＬ．ＰＡＥ　５　ｍｇ／ｍＬ对３种细胞４８　ｈ生长抑黼率分别为７８．７　、　８９．５　、５８．９　；ＰｗＥ对３种细胞降解ＭＴＴ　Ｉｃ５。值分别为０．８２、０．６Ｏ、０．８１　ｍｇ／ｍＬ，ＰＡＥ　５　ｒａｇ／　ＨＩＬ对３种细胞降解ＭＴＴ抑制率分别为９Ｏ．３　、９５．６　、６２．１％；ＰＷＥ　２ｍｇ／ｍＬ对３种细胞集落　抑制率分别为４７．８　、６３．４　、４３．６　｝ＰＡＥ　５　ｍｇ／ｍＬ对３种细胞集落抑黼率分别为６１．７　、　５４．６　、４５．３　。提示ＰＷＥ、ＰＡＥ有直接细胞毒作用，井和时间、剂量呈正相关，且ｐＷＥ作用比　ＰＡＥ强　美ｔ词　白头翁人肝癌７７２１细胞株人宫颈癌Ｈｅｌａ细胞株　人胃癌ＭＫＮ一４５细胞株抗肿　嚷缆确吃　怕　释成不同浓度的药液，４℃冰箱保存备用。　１．２瘤株及试剂：人肝癌７７２１细胞株由解　放军８１医院提供；人宫颈癌Ｈｅｌａ细胞株由　南京师范大学生物学系提供；人胃癌ＭＫＮ一　４５细胞株由上海细胞所提供。ＲＰＭＩ　１６４０・　白头翁为毛茛科植物Ｐｕｌｓａｔｉｌｌａ　ｃｈｉｎｅｎ一　（Ｂ　ｅ）Ｒｅｇｅｌ的干燥根，有清热解毒、凉血　止痢的功效，多用于热毒血痢症（如细菌性痢　疾、阿米巴痢疾），药理实验证明其有抗阿米　巴原虫、抗菌、抗漓虫作用。曾有报道对肺部　鳞癌、黑色素瘤有一定疗效　］，但临床一般不　作重要抗癌中草药使用，笔者在进行体外抗　肿瘤药物筛选时，发现其有较高的抗癌活性，　现报道如下。　１材料　ＧＩＢＣＯ产品，ＭＴＴ．Ｓｉｇｍａ产品。　２方法与结果　２．１　细胞计数法试验：取对数生长期形态佳　的３种瘤细胞，分别用０．２５　胰酶消化后．　用含ｌＯ　小牛血清１　６４０培养液将瘤细胞制　１．１药物：白头翁为本院中药房提供，南京　中医药大学中药学院刘文亮教授鉴定，符合药典正品标准。①水提液（ＰＷＥ）的制备：白　头翁５　ｇ，加蒸馏水适量，ｉ００℃加热６　ｈ，过　滤，滤液浓缩至Ｉ　ｇ生药／ｍＬ浓缩液，过滤除　成２×１０５／ｍＬ（７７２１细胞）、１．５×１０ｓ／ｍＬ　（Ｈｅｌａ细胞）、４×１０　／ｍＬ（ＭＫＮ一４５细胞）的　悬液，加入２４孔培养板，每孔１　ｍＬ，置５　ＣＯ　、３７℃的培养箱中，培养２４　ｈ后，吸出培　养液，按实验设计分别加＾药液，阴性对照用　苗．用含１Ｏ　小牛血清的ＲＰＭＩ　１６４０完全　培养基稀释成不同浓度的药液（根据预试验　相应培养液代之，每２４　ｈ镜检、照相记录，台　盼蓝染色法作活细胞计数，绘制细胞的生长　结果而定，浓度均以相当的生药量表示），４℃　冰箱保存备用。②醇提液（ＰＡＥ）的制备：白　头翁５　ｇ，９５　乙醇浸泡４８　ｈ，滤液浓缩至　曲线，并计算细胞生长抑制率［　＝（１一给药　组细胞数／对照组细胞数）×１００　］。　２．１．１　ＰＷＥ对３种瘤细胞生长增殖曲线的　干，用５　ｍＬ蒸馏水溶解，过滤除菌，用含　ｌＯ　小牛血清的ＲＰＭＩ　１６４０完全培养基稀　影响：见图１～３。　２．１．２　ＰＷＥ对细胞倍增时间（幻）的影响：　开爱质量标堆蒜　嗣订研究工作和中药降血●作善　莹螽辫蘩　用的实■研究。近年来．勰　从事于渊　箍　抗肿瘤中覃爵研诖工嚣作　篓・发最裴　论工　彖ＩＯ絮　再・　《中草药）１９９９年第３Ｏ蔷第６　・４４１・　维普资讯 http://www.cqvip.com

［１、　Ｈｘ一■一■　ｉ对』ｊ｝（２－Ｏ．６５Ｉ　ｍｇ／ｍＬ　３－０．９Ｉｉ　ｍｇ，／ｍＬ　４—１　２７６　ｍｇ／ｍＬ　５一ｌ－７８６　ｍｇ／ｍＬ　６－２－５００　ｒａｇ／ｍＬ　田１　ＰＷＥ对７７２１绷胞生长增殖曲蛙的影响　Ｘ　■　毫　时■ｆ（ｈ）　１一对照２－０　６５１　ｒａｇ／ｍＬ　３－０．９１１　ｍｇ／ｍＬ　４－１—２７５　ｍｇ／ｍＬ　５－］－７８６　ｍｇ／ｍＬ　６　２．５００　ｍｇ／ｍＬ　围２　ＰＷＥ对Ｈｅｌａ细胞生长增殖曲蛙的影响　：　色　Ｘ　釜　一　再　时旧Ｉ（ｈ）　１一对Ｊｌｌ【２－０．９１１　ｍｇ／ｍＬ　３－］．２７６　ｍｇ／ｍＬ　４一ｌ　７８６ｍｇ／ｍＥ　５－２－５００￣ｇ／ｍＬ　６－３－５００ｍｇ／ｍＬ　圈３　ＰＷＥ对ＭＫＮ・４５蛔胞生长增殖曲蛙　的影响　在指数生长期细胞生长　Ｄ一０．３０１　ｔ／１ｏｇｌ＇］ｔ—　ｌｏｇＮｏ，ｔ为细胞培养时间（ｈ），Ｎｏ及Ｎ　分　别代表接种时及培养￡ｈ的细胞数　ＰＷＥ　２．５　ｍｇ／ｍＬ　及延长率见表１，表明ＰＷＥ　能明显延长３种细胞倍增时间，影响存活细　胞的生长特性。　・４４２・　裹１　ＰＷＥ对３种绷胞ｔ。的影响　２．１．３对细胞生长抑制率的影响：随着时间　和剂量的增加，ＰＷＥ、ＰＡＥ对３种细胞生长　抑制率也增加，呈量效时效关系。ＰＷＥ对３　种细胞生长２４、４８、７２　ｈ的半数抑制浓度　ＩＣ　。见表２，ＰＡＥ（５　ｍｇ／ｍＬ）对３种细胞生长　抑制率见表３，说明ＰＷＥ作用比ＰＡＥ强　裹２　ＰＷＥ对３种细胞生长不同时间　的半数抑镧浓度ＩＣ＊（ｍｇ／ｍＬ）　裹３　ＰＡＥ（５　ｍｇ／ｍＬ）对３种细臆生长抑镧卑（　）　２．２　ＭＴＴ法测细胞增殖抑制率：分别收集　对数生长期的３种细胞（１ｘ１０　／ｍＬ），种人　９６孔培养板，每孔１００　Ｌ，置５　ＣＯ　、３７℃　的培养箱中，培养２４　ｈ后，吸出培养液，分别　按设计加人药渣，阴性对照用相应培养渣代　之，７２　ｈ后，每孔加人１０　Ｌ　ＭＴＴ（５　ｇ／Ｌ），　３７℃作用４　ｈ，除去上清液，加入ＤＭＳＯ溶　解，平板振蔼仪振荡１０　ｒａｉｎ，酶联免疫仪５７０　ｒＪ．ｍ波长检测各孔吸光度（Ａ）值，按公式计算　抑制率［％：（１一实验组Ａ值均数／对照组　Ａ值的均数）ｘ１００％］。ＰＷＥ作用结果见表　４。ＰＡＥ　５　ｍｇ／ｍＬ对７７２１、Ｈｅｌａ、ＭＫＮ一４５细　胞降解ＭＴＴ抑制率分别为９０．３　、　９５．６％、６２．１　。　２．３集落形成试验：将３００　ｅｅｌｌ／ｍＬ对数生　长期的单个分散细胞接种到６孔细胞培养板　中（培养渣含２０　ＦＢＳ），待细胞开始时，　吸出培养液，分别加人药液，阴性对照用相应　维普资讯 http://www.cqvip.com

培养液代之，５　ｄ后，更换培养液和相同量药　集落抑制率　＝（１给药组集落数／对照组　物．１０　ｄ后用氨基黑染色．计数集落数．计算　集落数）×１００　］。结果见表５　表４　ＰＶ，ｅＥ对３种细胞降解ＭＴ＇Ｉ＇的影响（Ｈ＝３）　寰５　ＰＷＥ、ＰＡＥ对３种细胞羹落　形成的抑制率（Ｈ＝３）　低，对大鼠几无毒　，所以在临床剂量下组织　药物浓度可达到有效抗肿瘤浓度。再根据５　ｇ　白头翁生药可制得ＰＷＥ约０．４　ｇ计算，对３　种肿瘤细胞７２　ｈ的１Ｃ　。值（实际ＰＷＥ浓度）　分别为７０．４、２２．４、６８．８￣ｇ／ｍＬ，亦符合ＩＣ　。　＜１００￣ｇ／ｍＬ认为有用的要求　，说明白头　翁在临床抗肿瘤方面有潜在价值，值得进一　步研究。　３讨论　３种方法结果一致，均表明ＰＷＥ、ＰＡＥ　实验结果还表明ＰＷＥ作用比ＰＡＥ强，　提示白头翁抗肿瘤活性成分系水溶性物质，　亦可部分溶于乙醇。究竟哪些成分是抗肿瘤　对３种肿瘤细胞有较强的抑制作用，ＰＷＥ　２　ｍｇ／ｍＬ左右就可产生非常显著的抑制肿瘤　细胞生长作用，提示白头翁抗肿瘤作用主要　通过其直接作用于肿瘤细胞所致．有无诱导　细胞分化作用，有待进一步研究。　白头翁成分复杂，主要有白头翁素、白头　翁英、白关翁灵、２３一羟基白桦酸、白头翁皂苷　活性成分．现在尚难定论，小鼠体内试验正在　进行，将另文发表。　参考文献　１王浴生主编　中药药理与应用社、１９９３：３３０　北京：人民卫生出版　２亭扳奎主编　中药药理学．北京：中国医药出舨社　１９９２　２１５　Ａｎ、Ｂ‘等，白头翁英、白头翁灵，有类似洋地　黄强　ｔ３作用，新鲜的白头翁含原白头翁素．对　皮肤粘膜有强烈刺激性，干燥久存的白头翁　因原白头翁素聚合为白头翁素，局部刺激作　用大为降低　］，白头翁煎剂及其皂苷毒性很　３江苏新医学院编．中药大辞典．上册．上海：上海人民　出版社，１９９７。７０５　４　椽扭云主编　药理实验方法学．北京：人民卫生出版　社，１９８２—１１３８　（１９９８—１卜２０收稿）　欢迎订阅１９９９年《中草药》杂志　《中草药》杂志是由国家药品监督管理局主管，中草药信息中心站、天津药物研究院主办的药学科技学术　期刊。每月２５日出版。从１９９９年１月起，本刊改为８Ｏ页，内容更加丰富，定价９．８元／期　邮发代号：６—７７，欢迎广大读者到当地邮局或来电编辑部办理订阅手续，　ｔ中草药　１９９９年第３０卷第６　・４，１３・　维普资讯 http://www.cqvip.com

一　规模培养的黄芪毛状根急性毒性研究△　２　ｌ　上海中医药大学中药研究所（２０ｏ∞２　＿￡—墨’童型　吴耀平　张海挂一刘　涤　胡之壁　摘　要　对黄苠毛状根、野生黄蓖和栽增黄芪的急性毒性进行了初步研究，结果表明三者均符台　药典规定的毒性要求，可安全药用。　关键词黄芪毛状根毒性　＿　～●——一———～　黄芪（膜荚黄芪Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｍｅｍ　ｌ、２野生和栽培黄芪水煎液的制备：野生黄　ｂｒａｎａｃｅｕｓ，蒙古黄芪Ａ．ｍｏｎｇｈｏｌｉｃｕｓ）是我　芪购自上海药材公司，经上海市中药质量监　国重要传统药材，每年需求量６００万ｋ　督检验室叶愈青教授鉴定为山西产膜荚黄芪　由于野生资源逐年减少和栽培品种品质下　（Ａ，ｍｅｍｂｒａｎａｏｅｕｓ　Ｆｉｓｃｈ．Ｂｇｅ）的干燥根。栽　降，给临床使用和中成药制造带来一定的困　培黄芪购自上海药材公司崇明分公司。制备　难。由发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｌｕｎ　方法同黄芪毛状根，分别浓缩至９８　ｍＩ　和　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）感染双子叶植物形成的毛状根，　１３３　ｍＬ，药液浓度分别为每毫升３．０６　ｇ和　具有生长迅速、生化性质和遗传性稳定以及　２－２６　ｇ。　易于进行基因操作等特点，近年来已发展成　１．３动物：昆明种小鼠．由上海中医药大学　进行工业化生产中药材的重要培养系统　］。　实验动物中心提供　体重１８～２２　ｇ．雌雄各　我室已成功地进行了黄芪毛状根的大规模培　半　养实验　．药理实验证明培养的毛状根具有　２实验方法　提高免疫功能和促进造血系统功能“］、抗自　取小鼠雌雄各半，预先禁食不禁水１　２　由基、改善记忆、抗衰老和保护肾功能的作　ｈ，将小鼠按体重随机分组（每组　一１０），分　用　为保证用药的安全性，我们对黄芪毛状根　别一次大剂量（０．４　ｍＬ／ｌＯｇ）ｉｇ黄芪毛状根　的急性毒性进行了初步研究，并与野生黄芪　６４．８９、７２、８Ｏ、８９　ｇ／ｋｇ，野生黄芪９７．９２　ｇ／　和栽培黄芪进行了比较。　ｋｇ，栽培黄芪９Ｏ、２３　ｇ／ｋｇ　观察小鼠死亡情　１实验材料　况，记录症状，连续７　ｄ，７　ｄ后再次称重　按　１．１黄芪毛状根水煎液的制备：利用我们设　寇氏法计算ＬＤ　。值及９５　可信限和平均可　计的培养系统　一培养的黄芪毛状根．经冷冻　信限　干燥制成粗粉，取３００　ｇ，加１０倍体积蒸馏水　３结果与讨论　浸泡２　ｈ，微火煮沸３０ｍｉｎ，４层纱布过滤，再　在７２、８０、８９　ｇ／ｋｇ　３组中．　给予黄芪　加６倍体积蒸馏水微火煮沸３０　ｍｉｎ．过滤后　毛状根的部分小鼠在１０　ｍｉｎ左右开始出现　合并滤液．３　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１５　ｒａｉｎ，合并上　身体发抖、摇晃、呼吸急促，持续１０～３０　ｍｉｎ　清液，浓缩至９７　ｍＬ　药液浓度为每毫升含生　后自发动作迟缓，四肢松软，继而产生剧烈抽　药３．０９　ｇ。　搐、惊厥现象，直至死亡，死亡动物解剖后未　Ａｄｄｒｅｓｓ｝Ｉ）Ｉｌ　Ｍｉｎ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｕｎｉｖｅｒ￣ｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔ　ｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｅｌａｅ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｌａ　Ｍｅｄｉｃａｔ　Ｓｈｏｎｇｈａｉ　杜曼　１９９８年６月毕生于中国药科太学中药学专生，莸硕士学位，研究宴习员。理从事中药生钫工程的研究工作，包　括组拳ｃ培养、成分墙稠以盈萄理作用　＊＊本控药理教研室　本研究由国家　九・五　攻关基金　国束自然科学基金和国家中医萄管理局科学研究基金支持　・４４４・　＠