分析16SrRNA基因部分序列鉴定一株乳酸菌

2008年6月JOURNALOFHARBINMEDICALUNIVERSITYJun.,2008

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分析16SrRNA基因部分序列鉴定一株乳酸菌

付晓艳

3

(哈尔滨医科大学地方病控制中心大骨节病研究所,黑龙江哈尔滨150081)

[摘要]　目的　利用聚类分析16SrRNA基因部分序列的方法对乳酸菌进行鉴定。方法　在表型鉴定的基础上,应

用已发表的16SrRNA基因序列设计引物,扩增L.sp.L5菌株16SrRNA基因,并进行测序,将结果与同属及非同属的乳酸菌进行同源性比较。结果　L.sp.L5菌株与同属的乳酸乳球菌同源性为85.5%以上,尤其与乳酸乳球菌叶蝉亚种NCDO2181T同源性为99.5%,与不同属的肉明串珠菌、漫游球菌、嗜盐四联球菌同源性分别为77.5%、

82.8%、79.0%。结论　菌株L.sp.L5为乳酸乳球菌。[关键词]　乳酸菌;16SrRNA基因;鉴定

[中图分类号]Q939.117　　[文献标识码]A　　[文章编号]1000-1905(2008)03-0265-03

Analyzeapartof16SrRNAgenesequencetoidentifyastrainofLactobacillus

FUXiao2yan

(InstituteofKaschin2BeckDisease,CenterforEndemicDiseaseControl,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China)

Abstract:Objective　ToidentifyastrainofLactobacillusbyusingapartof16SrRNAgenesequenceandclusteranalysis.Methods　Thegeneof16SrRNAfromthestrainofL.sp.L5wasamplifiedwiththeprimersdesignedbythereported16SrRNAsequence.The16SrRNAsequenceofL.sp.L5wascomparedwithotherstrainsoflacticacidbacteria.Results　ThehomologyofL.sp.L5withL.lactiswasabove85.5%,butlowerthan82.8%withLeuconostoccarnosu,VagococcusfessusorTetragenococcushalophilus.Conclusion　L.sp.L5maybeastrainofL.lactis.

Keywords:Lactobacillus;16SrRNAgene;identification

　　早在上世纪60年代末,有科学家开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类,他们通过比较各类生物细胞的核糖体RNA(rRNA)特征序列,认为16SrRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。细菌的16SrRNA基因具有高度的保守性,不同种间细菌16SrRNA基因的同源性可

[1]

达97%以上。为了分离不同种的乳酸菌,Collins[2]

等测定了大量乳球菌16SrRNA的一级结构,并阐

[3]

明了它们在系统发育中的亲缘关系。Weisburg等提出,利用16SrDNA扩增的方法可以在不需要大量扩大培养的情况下,对那些需要营养条件极端复杂或具有高度致病性的细菌进行系统发育的研究。该方法操作方便、检测快速准确且灵敏度高,已被广泛应用到菌种鉴定、群落对比分析、群落中系统发育及

种群多样性的评估等领域,是一种客观和可信度较

[4]

高的分类方法。

利用16SrRNA基因的这一特点,对从牛乳中分离的一株细菌进行分析。该菌株细胞呈卵圆形,单生、成对或成链状,与过氧化氢酶反应呈阴性。革兰氏染色呈阳性,无运动性,属兼性厌氧菌。该菌株能在10℃下生长,但不能在45℃下生长。综合上述特征,初步判定该菌株系乳酸球菌属,定名为L.sp.L5。1　材料与方法111　材料

菌株为由乳品科学教育部重点实验室自牛乳中分离得到的L.sp.L5。1.2　PCR引物根据乳酸球菌的16SrRNA基因序列保守区域,利用PrimerPremier5软件设计一对引物,上游引物5′2GGTGTAGCGGTGAAATGCGAA23′,下游引物5′2CAGCCTACAATCCGAGCTGAG23′。

[收稿日期]2007-10-12

[作者简介]付晓艳(1979-),女,黑龙江哈尔滨人,硕士,研究实习

员。3通讯作者

2661.3　方法

哈尔滨医科大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第42卷　　

1.3.1　L.sp.L5菌株基因组DNA的提取:取16～18h的菌体培养物12000rΠmin离心30s。加入100

μgΠmL的溶菌酶50μL,37℃处理1h。再加入200μL裂解缓冲液(40mmolΠLTris2HCl,pH8.0,20mmolΠL乙酸钠,1mmolΠLEDTA,1%SDS),使细菌细胞完全裂解。向其中加入66μL5mmolΠL的NaCl,混匀后离心。上清中加入等体积的Tris饱和酚,混合后离心,再用等体积的氯仿抽提。用预冷的二倍体积无水乙醇沉淀DNA,70%乙醇清洗。真空干燥后,用TE缓冲液溶解。

1.3.2　L.sp.L5菌株16SrDNA的部分序列分析:取L.sp.L5菌株基因组DNA1μL作为PCR反应模

[5]

板。PCR反应条件为95℃1min,55℃1min,70℃2min,循环数35。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后,EB染色,出现634bp条带(附图)。将回收的634bp片段与T载体连接,酶切鉴定,测序。100bpDNALadderMarker条带为1500bp,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp。

1.3.3　16SrDNA的聚类分析:通过GenBank数据清晰条带(阴性对照无该长度片断),其大小与100bp梯度Marker相比较,位于600～700bp之间,回收产物片断长度相同。该片段与T载体相连后,转化至大肠杆菌感受态细胞JM109中,从中提取质粒,经性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后,得到2条清晰条带,与λ2EcoT14Marker和100bp梯度Marker比较,长度分别在2690bp和700bp附近,初步证明PCR与载体连接成功(附图)。

附图　16SrDNA634bp凝胶电泳

λ1.Marker:2EcoT14;2.HindⅢ和EcoRⅠ双酶切产物(2635bp,691

bp);3.100bpDNALadderMarker;4.PCR产物回收物,634bp;5.

L.sp.L5菌株PCR产物,634bp;6.PCR阴性对照

库,提取乳球菌属的代表菌株的16SrDNA序列:乳

酸乳球菌乳脂亚种NCDO607;乳酸乳球菌乳酸亚种NCDO604;乳酸乳球菌叶蝉亚种NCDO2181T;植物乳球菌NCDO1869;棉籽糖乳球菌NCDO617;格氏乳球菌NCDO2156;鱼乳球菌NCFB2778。再提取非同属的肉明串珠菌ATCC49367、漫游球菌BAA22、嗜盐四联球菌ATCC33315的16SrDNA序列。采用DNAMAN软件序,用L.sp.L5菌株的16SrDNA序列分别与各类乳球菌及其它非同属的乳酸细菌16SrDNA序列进行比较,得出相应相似度百分比2　结果

211　L.sp.L5菌株16SrDNA的634bp序列电泳结果

[6]

2.2　L.sp.L5菌株16SrDNA部分序列测序结果

测序工作由大连TaKaRa生物公司完成(图略)。

由测序结果可以看出,与T载体相连接的片断长度为634bp。由于两个性内切酶的酶切位点距PCR产物634bp片断比较远,所以在HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点之间会增加57个碱基,双酶切后会得到2条长度分别为2635bp和691bp的片断。上述测序结果与电泳结果符合。

2.3　L.sp.L5菌株16SrDNA部分序列与其它菌株

。

的相似百分比

由附表中各菌株的相似性百分比可知,菌株L.sp.L5的16SrDNA部分片断(634bp)与同属的7株菌的16SrDNA相似性百分比在85.5%以上,与非同属的3株菌比值则低于82.8%。

对菌株L.sp.L5的16SrDNA扩增后,可见到一

附表　11株乳酸菌的16SrDNA部分序列相似百分比(%)

菌株

1

12345

(L5)(NCDO607)(NCDO604)(NCDO2181T)(NCDO1869)

10099.599.599.585.5

10098.798.886.2

10098.385.9

10086.0

100

2

3

4

16SrDNA序列相似百分比(%)

5

6

7

8

9

10

11

第3期　　　　　　　　　　　　　付晓艳,等1分析16SrRNA基因部分序列鉴定一株乳酸菌

267

　　续表

菌株

1

671011

(NCDO617)(NCDO2156)(NCFB2778)(ATCC49367)(ATCCBAA22)(ATCC33315)

87.195.386.077.582.879.0

287.995.886.878.183.579.7

387.695.886.477.883.279.4

487.695.886.577.983.379.5

16SrDNA序列相似百分比(%)

595.985.097.785.491.787.4

610085.296.185.791.987.8

10085.178.782.179.3

10085.591.687.1

100.288.8

10093.9

100

7

8

9

10

11

3　讨论

　　细胞的核糖体是由核糖体RNA(rRNA)和蛋白质组成。它可以把保存在核酸中的遗传信息转换成以蛋白质为基础的结构信息,从而执行不同的功能。生物体在漫长的进化过程中,rRNA基因都保持着相对恒定的生物学功能,而且其碱基排列顺序有些部分变化缓慢,甚至还保留了古老祖先的一些序列,保守性极高,因此,从这种排列顺序可以探测出其种系发生上的深远关系。rRNA在细菌细胞中含量很大,并且较容易提取,有足够的量用于比较研究。

细菌的核糖体RNA包括3种类型:5S、16S和23SrRNA。其中5SrRNA最容易分析,但由于其含有的核酸较少,没有足够的遗传信息用于研究。23SrRNA所含有的核酸碱基数量几乎是16SrRNA的二

生理生化和表型鉴定结果符合。而且该菌株的16SrDNA序列与乳酸乳球菌的16SrDNA序列同源性高

[1]

达99%以上,与Jonas等提到的同源性大于97%相一致,所以该菌株与乳酸乳球菌亲缘关系最近,可以认为该菌株是一株乳酸乳球菌。该结果也进一步证明了所设计的一对引物可以用于扩增乳酸乳球菌的16SrDNA序列。

[参考文献][1]　JonasD,RosenbaumA,WeyrichS,etal.Enzyme2linkedimmunoassay

fordetectionofPCR2amplifiedDNAofLegionellaeinbronchoalveolarfluid[J].JClinMicrobiol,1995,33(5):124721252.

[2]　CollinsMD,AshC,FarrowJA,etal.16Sribosomalribonucleicacid

sequenceanalysesoflactococciandrelatedtaxa.DescriptionofVago2coccusfluvialisgen.nov.,sp.nov[J].JApplBacteriol,19,67(4):4532460.

[3]　WeisburgWG,BarnsSM,PelletierDA,etal.16SribosomalDNAam2

plificationforphylogeneticstudy[J].JBacteriol,1991,173(2):6972703.

[4]　雷正瑜.16SrDNA序列分析技术在微生物分类鉴定中的应用

[J].湖北生态工程职业技术学院学报,2006,1(3):8211.[5]　林万明.PCR技术操作和应用指南[M].北京:人民军医出版

倍,用于分析较困难。由于16SrRNA的核酸数量适

中,所以用于分类分析最理想。现在人们已经认同,16SrRNA基因序列可用于评价生物的遗传多态性(geneticdiversity)和系统发生关系(phylogeneticrela2tionship),在细菌分类学中可作为一个科学可靠的辅助指标。因为所有的细菌种类至少有1个16SrRNA基因拷贝,而且不受观察者的主观看法所影响,如果2个16SrRNA基因序列不同,那么就是不

[8]

同的菌种。

本实验中,菌株L.sp.L5的16SrDNA序列与乳球菌属的不同菌株同源性为85.5%～99.5%,与其

[7]

社,1993:231.

[6]　黄正根,刘昕.应用16SrDNA检测致病菌的研究进展[J].中华

检验医学杂志,2005,28(6):6632665.

[7]　黄庆生,王加启.16SrRNAΠrDNA序列分析技术在瘤胃细菌微

生态系统研究中的应用[J].中国畜牧兽医,2003,30(1):7211.

[8]　杨祖卿,尚世强.16SrRNA基因在临床上的应用进展[J].国外

医学儿科学分册,2005,(32)4:2522255.

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